Avances en la bioseparación
El aislamiento de enzimas es sencillo, pero problemático y lleva mucho tiempo.
Introducción a los métodos de separación y purificación de enzimas
Hay dos tipos de enzimas producidas por las células biológicas: una es una enzima producida dentro de la célula y secretada fuera de la célula, llamada enzima extracelular . La mayoría de estas enzimas son hidrolasas. Por ejemplo, Bacillus subtilis y enzimas de la raíz secretan dos enzimas amilasa utilizadas en la producción enzimática de glucosa durante la fermentación. Este tipo de enzima generalmente tiene un alto contenido y es fácil de obtener; otra enzima no se secreta fuera de la célula después de ser producida en la célula, pero desempeña un papel catalítico dentro de la célula. Una serie de reacciones químicas en la producción de fermentación denominadas enzimas intracelulares, como el ácido cítrico, el ácido inosínico, el glutamato monosódico, etc., se realizan bajo la catálisis de varias enzimas intracelulares. En las células, las enzimas a menudo se combinan con estructuras celulares, tienen un área de distribución determinada y catalizan reacciones en un orden determinado, lo que permite que muchas reacciones se desarrollen de manera ordenada.
La mayoría de las fuentes de enzimas son células biológicas. Aunque la cantidad total de enzimas producidas por las células biológicas es alta, la cantidad de cada enzima es muy baja. Por ejemplo, existen muchos tipos de enzimas hidrolíticas en el proceso de digestión intermedia del páncreas, pero el contenido de cada enzima varía mucho.
Entonces, al extraer una enzima, primero se debe seleccionar el material con mayor contenido enzimático, como el páncreas, que es un buen material para extraer tripsina, quimotripsina, amilasa y lipasa. Dado que las preparaciones enzimáticas extraídas de despojos de animales o frutos vegetales están limitadas por las materias primas, si no se pueden utilizar de forma integral, el coste será muy alto. Actualmente, una gran cantidad de preparaciones enzimáticas en la industria se obtienen cultivando microorganismos. El uso de microorganismos para producir preparaciones enzimáticas tiene muchas ventajas y no está limitado por las condiciones climáticas y geográficas. Además, la mayoría de las enzimas de animales y plantas se pueden encontrar en microorganismos, que pueden reproducirse rápidamente y producir abundantes enzimas. Los rendimientos también se pueden aumentar mediante la selección de cepas bacterianas y se puede lograr una producción en masa con materias primas baratas.
En los tejidos biológicos, además del que necesitamos, suele haber muchas otras enzimas, proteínas y otras impurezas. Por tanto, a la hora de preparar preparados enzimáticos, se deben llevar a cabo procedimientos de separación y purificación.
La enzima es una proteína con actividad catalítica. Las proteínas se desnaturalizan fácilmente, por lo que durante el proceso de purificación de la enzima se deben evitar los ácidos y álcalis fuertes y se debe mantener la temperatura baja. Durante el proceso de purificación, es más fácil rastrear el paradero de la enzima durante el proceso de aislamiento y purificación midiendo su actividad catalítica. La actividad catalítica de las enzimas también se puede utilizar como indicador para seleccionar métodos de separación y purificación y condiciones operativas. En cada paso de todo el proceso de separación y purificación de la enzima, se debe medir continuamente la actividad total y la actividad específica de la enzima para saber cuánta enzima se ha recuperado en un determinado paso y cuánto se ha mejorado la pureza, determinando así la elección de un determinado paso.
El aislamiento y purificación de enzimas suele implicar tres pasos básicos: extracción, purificación, cristalización o preparación. Primero, la enzima requerida se introduce en la solución de la materia prima. La solución inevitablemente contiene algunas impurezas y luego la enzima se separa selectivamente de la solución, o las impurezas se eliminan selectivamente de la solución y luego se prepara la enzima purificada. . preparación. La siguiente es una introducción completa a los métodos comunes para el aislamiento y la purificación de enzimas:
1. Tecnología de pretratamiento y separación sólido-líquido
1 Ruptura celular
Alta. -método homogeneizador a presión: este método se puede utilizar para triturar levadura, E. coli, Pseudomonas, Bacillus e incluso Aspergillus niger. Cuando la suspensión celular se introduce en un orificio de descarga con un tamaño de poro ajustable a alta presión, las células se rompen fácilmente cuando las bacterias se transfieren de un ambiente de alta presión a un ambiente de baja presión. La tasa de alteración celular de la suspensión bacteriana que pasa a través del homogeneizador es del 12% al 67%. La tasa de alteración celular está relacionada con el tipo de célula. Para lograr una tasa de destrucción celular superior al 90%, la suspensión bacteriana debe pasarse por el homogeneizador al menos dos veces. Es mejor aumentar la presión quirúrgica y reducir el número de operaciones. Pero se informa que cuando la presión operativa alcanza los 175 Mpa, la tasa de trituración puede alcanzar el 100%. Cuando la presión supera los 70 Mpa, la tasa de destrucción celular aumenta lentamente. La válvula del homogeneizador de alta presión es un factor importante que afecta la tasa de destrucción celular. Las bacterias filamentosas pueden obstruir las válvulas de un homogeneizador, especialmente cuando las concentraciones bacterianas son altas. Las E. coli cultivadas en medios ricos son más difíciles de alterar que las cultivadas en medios sintéticos.
Tratamiento con enzimas bacterianas: La clara de huevo es rica en lisozima, que es barata y se utiliza a menudo para disolver las células. Específicamente, se colocaron 43 kg de Micrococcus que disuelve la pared en una solución de cloruro de sodio al 0,5 % para lograr una concentración celular del 5 % (peso seco) y se trataron con 0,68 kg (peso seco) de clara de huevo a 35 °C durante 20 minutos, y Los fragmentos celulares resultantes se tratan con un volumen igual de etanol.
Elimine los restos celulares y las proteínas intracelulares mediante centrifugación y luego aumente la concentración de etanol al 75%.
Centrifugación
El proceso de separación centrífuga se puede dividir en tres tipos: filtración centrífuga, sedimentación centrífuga y separación centrífuga. Los equipos utilizados son centrífugas de filtrado, centrífugas decantadoras y centrífugas. El filtro centrífugo tiene pequeños orificios en la pared del cilindro y medio filtrante en la pared del cilindro. Generalmente se puede utilizar para manejar situaciones en las que las partículas sólidas suspendidas son grandes y el contenido de sólidos es alto. La centrífuga de sedimentación se utiliza para la separación sólido-líquido con baja concentración de sólidos, como bacterias en caldo de fermentación, proteínas o disolventes orgánicos tratados mediante el método de sal, etc. El separador se utiliza para separar dos emulsiones inmiscibles con densidades ligeramente diferentes o emulsiones que contienen trazas de partículas sólidas.
Además de los requisitos generales de las centrífugas, el sistema de centrífuga utilizado en el campo biológico también debe cumplir con los requisitos técnicos de la producción biológica, incluida la esterilización, el enfriamiento, el sellado, etc., para garantizar que el producto sea no contaminado y el medio ambiente Libre de contaminación. Los dispositivos de centrifugación modernos incluyen, además del control del programa, los siguientes tres pasos: centrifugación, esterilización del sistema de centrífuga y limpieza in situ. Por ejemplo, los productos centrífugos de Alpha-Lava tienen sellos biaxiales, que consisten en anillos móviles de carburo de silicio y anillos fijos instalados en los ejes superior e inferior del tambor. El sello se enfría y lubrica continuamente con agua, lo que evita que la contaminación del producto y los desechos vertidos durante el proceso de producción contaminen el medio ambiente. La centrífuga es como un recipiente a presión sellado y puede esterilizarse con vapor a una temperatura de 121°C. La centrífuga está equipada con una camisa de enfriamiento alrededor del tambor de la centrífuga, que puede enfriar completamente la suspensión y los sólidos concentrados y controlar eficazmente la temperatura, lo cual es muy importante para los productos biológicos. Por ejemplo, la centrífuga BTPX205 se puede utilizar para la recolección de células, la purificación de fluidos de cultivo y la separación de restos celulares, y se puede utilizar para la extracción de vacunas, preparaciones enzimáticas, etc. Otros sistemas auxiliares y sistemas de control de la máquina también son relativamente completos, como indicadores de presión, dinamómetros, sensores de temperatura, sensores de nivel de líquido, etc.
3. Tecnología de separación por membranas
La ultrafiltración es la principal tecnología de separación por membranas utilizada en la purificación de proteínas. Bajo la acción de la presión estática, la solución pasa a través de la membrana filtrante con un tamaño de poro muy pequeño, lo que permite que los solutos con menor peso molecular en la solución pasen a través de la membrana, mientras que las moléculas grandes quedan atrapadas en la superficie de la membrana. La mayoría de las membranas de ultrafiltración constan de una membrana funcional muy delgada y una membrana de soporte gruesa. La membrana funcional determina el tamaño de los poros de la membrana, mientras que la membrana de soporte proporciona resistencia mecánica para resistir la presión estática. Las ventajas de la concentración por ultrafiltración son: condiciones de funcionamiento suaves, sin cambio de fase y sin destrucción de sustancias biológicamente activas.
El sistema de ultrafiltración consta principalmente de un tanque de almacenamiento de líquido de alimentación, una bomba, un ultrafiltro y un tanque de recolección de permeado. El líquido de alimentación se bombea al ultrafiltro mediante la bomba, el agua y las sustancias de bajo peso molecular se descargan del ultrafiltro y el líquido de alimentación concentrado circula en el tanque de almacenamiento de líquido de alimentación, la bomba y el ultrafiltro. Cuando el líquido de alimentación se concentra hasta un cierto múltiplo, se puede procesar adicionalmente como un líquido de alimentación concentrado.
Cuando se aplica la ultrafiltración a la concentración y desalinización de sustancias proteicas, se debe prestar atención a las siguientes cuestiones: En primer lugar, durante el ciclo de ultrafiltración, debido a la fricción exotérmica entre la bomba y el impulsor y el líquido de alimentación. , la temperatura del líquido de alimentación irá aumentando progresivamente, provocando la pérdida de moléculas de proteínas. Por lo tanto, el tanque de almacenamiento de líquido debe estar equipado con un sistema de enfriamiento y un sistema automático de control y medición de temperatura. En segundo lugar, la pérdida de cofactores en algunas enzimas es un problema: algunas enzimas contienen cofactores con pesos moleculares pequeños que se eliminan fácilmente del permeado durante la ultrafiltración, por lo que se debe agregar una cierta concentración de cofactores antes o después de la ultrafiltración.
La ultrafiltración también se puede combinar con cromatografía de afinidad para mejorar la pureza de la separación. Su principio de funcionamiento es: cuando la proteína que se va a separar en la solución pasa sin obstáculos a través de los microporos de la membrana de ultrafiltración, si hay un ligando de afinidad unido a un lado de la membrana, la proteína se unirá al ligando, uniéndose así al ligando en este lado de la membrana. Coalescencia lateral. Otras especies no unidas al ligando serán arrastradas a través del poro. Luego, la proteína se eluye con un eluyente adecuado, que se utiliza para una mayor separación y purificación.
4. Separación de espuma
Principio: cuando se introduce gas en una solución que contiene múltiples componentes, algunos componentes aparecerán en la superficie de la solución debido a las diferentes actividades superficiales de estos componentes. Se forma una espuma cuya estabilidad depende de las condiciones de funcionamiento y de las propiedades biológicas de la solución. La espuma contiene más ingredientes tensioactivos, por lo que los tipos y contenidos de los ingredientes de la espuma son diferentes de los de las soluciones. De esta forma se pueden separar los componentes de la solución.
Las proteínas se adsorben fácilmente en la interfaz aire-líquido, lo que resulta beneficioso para la estabilidad de su estructura. El proceso de separación de la espuma es: difusión de proteínas desde la solución principal a la interfaz aire-líquido, que puede ser reversible o irreversible, se reorganizan las moléculas y generalmente se cree que se formarán dos tipos de membranas en la interfaz aire-agua; una es una película delgada, la otra es una película gruesa, que puede causar que múltiples moléculas se aglutinen. Las películas de proteínas formadas en la interfaz aire-líquido pueden ser de una o varias capas.
El tipo de membrana depende de las propiedades, estructura y concentración de las proteínas en la solución principal y en la interfaz aire-líquido.
El propósito de la separación de la espuma es mejorar la tasa de enriquecimiento de la proteína enzimática (concentración de proteína en la espuma/concentración de proteína en la solución inicial) y la tasa de extracción de la proteína enzimática (tasa de extracción de proteína en la espuma/ cantidad inicial de proteína), o para maximizar el coeficiente de partición de un componente en una mezcla multicomponente.
En segundo lugar, retire los
depósitos
1. Salado
El agente salado comúnmente utilizado es el sulfato de amonio, que tiene una alta solubilidad. y bajo precio. El sulfato de amonio tiene una gran capacidad para precipitar proteínas y su solución saturada puede precipitar la mayoría de las proteínas. No tiene ningún efecto dañino sobre las enzimas.
Control del valor del pH: Se debe considerar la solubilidad y estabilidad de la enzima. Cuando se alcanza el punto isoeléctrico de la enzima, su solubilidad es mínima y es fácil de precipitar. Sin embargo, algunas enzimas se vuelven inestables cuando alcanzan nuevamente el punto isoeléctrico, por lo que se debe seleccionar el valor de pH óptimo. Generalmente, el valor de pH más adecuado para la precipitación de enzimas debe considerarse bajo la premisa de que el valor de pH de la enzima es el más estable. Una vez que se determina el valor de pH óptimo durante la operación, se debe usar ácido fórmico o álcali para ajustar el valor de pH de la solución enzimática antes de agregar sulfato de amonio para evitar fluctuaciones en el valor de pH de la solución, que pueden dañar la estabilidad de la enzima. Al agregar sulfato de amonio, preste atención a la agitación y a la velocidad de adición del sulfato de amonio. Generalmente, agregue sulfato de amonio lentamente de menos a más y muélalo hasta obtener un polvo fino tanto como sea posible.
Control de temperatura: algunas enzimas tienen mejor estabilidad a temperaturas más altas y pueden salarse a temperatura ambiente. Sin embargo, para la mayoría de las enzimas, es mejor operar a bajas temperaturas.
Ajustar la solución enzimática: Después de añadir sulfato de amonio, dejar reposar la solución enzimática durante un periodo de tiempo para permitir que la proteína enzimática precipite por completo. Una vez que la enzima haya reposado, no se debe agitar.
2. Precipitación con disolventes orgánicos
Selección de disolventes orgánicos: Los disolventes orgánicos que se pueden utilizar para la precipitación de proteínas enzimáticas incluyen alcoholes, como metanol, etanol, alcohol isopropílico, etc. El etanol tiene buena hidrofilicidad y puede prevenir la desnaturalización de las proteínas, y la solubilidad de las proteínas enzimáticas en él también es baja.
Operación de precipitación con disolventes orgánicos: los disolventes orgánicos generalmente desnaturalizan las proteínas cuando la temperatura es alta, las moléculas de proteínas desnaturalizadas quedarán permanentemente inactivas. Por lo tanto, es mejor tratar con disolventes orgánicos por debajo de 0°C. Las proteínas enzimáticas precipitadas por disolventes orgánicos no deben dejarse demasiado tiempo y deben disolverse en agua lo antes posible.
3. Precipitación de floculantes poliméricos
Los floculantes poliméricos, como el dextrano, el polietilenglicol, etc., compiten con las moléculas de enzima por las moléculas de agua y tienen un efecto deshidratante para precipitar la enzima. . La ventaja del polietilenglicol como agente precipitante es que la concentración en solución acuosa puede alcanzar el 50% y la mayoría de las proteínas con una concentración del 6% al 12% pueden precipitar. Este reactivo no requiere operación a baja temperatura y tiene cierto efecto protector sobre la estabilidad de las proteínas. El polietilenglicol no se adsorberá, por lo que no es necesario eliminarlo antes de la adsorción por intercambio iónico.
4. La precipitación con iones y complejos metálicos
Las enzimas y otras proteínas pueden formar sales metálicas de baja solubilidad. La desventaja de utilizar iones metálicos para precipitar es que los cambios reversibles de las enzimas después de interactuar con iones metálicos son pobres, especialmente la interacción con derivados de sulfhidrilo, que catalizarán la desnaturalización e inactivación de la enzima.
5. Utilice un método de precipitación de reactivo especial.
La estreptomicina puede eliminar selectivamente los ácidos nucleicos y así precipitar las enzimas intracelulares. La sal de estreptomicina (concentración: 0,5-1,0 mg/mg de proteína) es más eficaz para precipitar selectivamente ácidos nucleicos que los iones de manganeso, y la enzima no se inactiva fácilmente.
6. Precipitación por afinidad
La tecnología de precipitación por afinidad combina orgánicamente la alta selectividad y el bajo rendimiento de la reacción de afinidad con el alto rendimiento y la selectividad de la operación de precipitación formada. El ligando se acopla con un portador soluble para formar un complejo portador-ligando, que puede precipitar después de unirse a biomoléculas en determinadas condiciones.
El complejo ligando-portador puede unirse selectivamente a proteínas, y el valor del pH, la fuerza iónica, la concentración de proteínas y otras condiciones de la solución tienen poco efecto sobre la afinidad de unión. Sólo los ligandos competitivos reducirán la unión por afinidad del producto al ligando original, o incluso revertirán la unión por afinidad.
Los métodos para inducir la precipitación incluyen: reticulación iónica; agregar polímeros con cargas opuestas; agregar grupos hidrofóbicos con cargas opuestas; cambiar el valor del pH para inducir la precipitación hidrofóbica;
Unión por afinidad: agregue el ligando de afinidad a la solución que contiene la proteína objetivo y ajuste las condiciones relacionadas con la precipitación para promover la unión por afinidad.
Lavado: Con precipitación por afinidad de la solución cruda tratada, puede ocurrir unión no específica, especialmente cuando se utilizan polímeros cargados. La acción del intercambio iónico hará que otras proteínas precipiten juntas, por lo que el precipitado debe lavarse antes de aislar el compuesto objetivo.
El método es el siguiente: agregar agentes de limpieza apropiados para redisolver el precipitado y luego precipitar o lavar bien el precipitado antes de la elución específica; Durante el proceso anterior, la proteína de interés siempre debe mantener la afinidad de unión al ligando.
Separación del complejo ligando-portador y la proteína diana: Después de la separación, es necesario asegurar la recuperación de la proteína diana y el complejo ligando-portador. La proteína diana debe alcanzar una cierta pureza y tener una alta recuperación. tasa. .