Plan tecnológico de detección de laboratorio del virus de la influenza A H1N1 Este plan tiene como objetivo
1. Tipos y requisitos de recolección de muestras
1. Tipos recomendados de muestras respiratorias para recolectar
Las siguientes muestras deben recolectarse lo antes posible después del inicio. de enfermedad: hisopos nasales, hisopos de garganta, aspirados nasales y lavado nasal. También se deben recolectar aspirados traqueales de pacientes intubados. Las muestras deben colocarse en una solución de muestreo de virus estéril y almacenarse inmediatamente con cubitos de hielo o cubitos de hielo o colocarse a 4°C (refrigerador) y enviarse al laboratorio de inmediato. (Para conocer las pautas de control de infecciones para el personal de recolección de muestras clínicas y el personal de pruebas de laboratorio, consulte los documentos pertinentes). Al mismo tiempo, complete la lista de muestra de casos sospechosos de infección humana por H1N1. (Apéndice 1)
2. Selección de hisopos de algodón
La muestra debe utilizar un hisopo con cabezal de fibra sintética (por ejemplo, fibra de poliéster) y mango de aluminio o plástico. No se recomiendan bastoncillos de algodón ni mangos de madera. El tubo de recolección de muestras debe contener 3 ml de solución de muestreo de virus (que contiene estabilizadores de proteínas, antibióticos para prevenir el crecimiento bacteriano y fúngico, y tampones).
3. Requisitos de almacenamiento de muestras clínicas
Almacenado a 4 ℃ (no más de 4 días) o -70 ℃ o menos. Los laboratorios condicionales deben mantenerse a -70°C o menos. No debe almacenarse a -20°C.
4. Envasado y procesamiento de las muestras
Una vez enviadas las muestras al laboratorio, deben procesarse inmediatamente para evitar su congelación y descongelación repetidas. La muestra original se divide en tres partes, una parte se usa para la detección de ácido nucleico, una parte se usa para el aislamiento del virus y una parte se guarda para un nuevo examen.
5. Transporte de muestras
Los casos sospechosos de infección humana por H1N1 se clasifican en Categoría A y se transportan en embalajes UN2814. Complete el "Formulario de presentación de casos de infección humana sospechada de infección por H1N1 tipo A" (Apéndice 2).
En segundo lugar, la detección de ácido nucleico
El método de detección de ácido nucleico basado en el principio de PCR es un método de diagnóstico rápido y eficaz, que ha desempeñado un papel muy importante en la respuesta de emergencia a enfermedades infecciosas. enfermedades.
1. Detección del nuevo virus de la influenza A H1N1 basada en RT-PCR en tiempo real (secuencias de cebadores y sondas diseñadas por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades
El 29 de abril); , OMS El sitio web de la organización anunció los cebadores y sondas de RT-PCR en tiempo real diseñados por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades para este virus de la influenza A. Esta prueba se utiliza para detectar muestras respiratorias sospechosas de contener el virus de la influenza A. Por lo tanto, se recomienda utilizar este método de RT-PCR en tiempo real para detectar primero los virus de la influenza A y excluir los virus de la influenza estacional y el H5N1. Para conocer el método RT-PCR en tiempo real, consulte el Anexo 3 (traducción al chino) y el Anexo 4 (versión original en inglés).
2. Basado en RT-PCR (secuencia de cebadores diseñada por el Centro Nacional de Influenza) para detectar el nuevo virus de la influenza A h 1n 1
Actualmente, el Centro Nacional de Influenza ha diseñado; RT-PCR para detectar el nuevo tipo de virus de la influenza Virus de la influenza A H1N1. Consulte el Apéndice 5 para conocer el método RT-PCR.
En tercer lugar, aislamiento e identificación del virus
Se pueden utilizar embriones de pollo y/o células MDCK para aislar los virus de la influenza. Los laboratorios de la red con las condiciones correspondientes deben realizar la inoculación del virus dentro de las 24 horas posteriores a la recepción de las muestras. Consulte el Apéndice 6 y el Apéndice 7 para conocer métodos específicos.
Cuatro. Bioseguridad del virus de la influenza A H1N1 para el personal de laboratorio
(1) Nivel de laboratorio y protección personal
1. Tratar a pacientes con sospecha de infección por influenza A en laboratorios BSL-2 Muestras clínicas recolectadas de pacientes con el virus H1N1 se utilizaron para experimentos de diagnóstico. Todas las operaciones de muestreo deben realizarse en una cabina de seguridad biológica (BSC). Seguir protección personal nivel 3 de bioseguridad.
2. El aislamiento del virus y el cultivo de muestras clínicas recolectadas de pacientes con sospecha de infección por el virus de la influenza A (H1N1) deben realizarse en un laboratorio BSL-3 y seguir el nivel de bioseguridad tres.
(2) Monitoreo de la salud
1. Todo el personal se autoexamina para detectar fiebre y otros síntomas.
2. Los síntomas del virus de la influenza A H1N1 incluyen tos, dolor de garganta, vómitos, diarrea, dolor de cabeza, secreción nasal y dolor muscular. Si no se siente bien, debe informarlo inmediatamente a su supervisor.
3. Si alguien queda expuesto a muestras clínicas o virus vivos de un caso confirmado de influenza A (H1N1) sin protección, se debe considerar el uso de oseltamivir o Zanax dentro de los 7 días posteriores a la exposición a Mivir para profilaxis antiviral. .
Programas y anexos del verbo (abreviatura de verbo)
Anexo 1 Tabla de muestra de sospecha de infección humana por el tipo A H1N1
Anexo 2 Sospecha de infección humana por el tipo A Muestras infectadas con H1N1
Anexo 3: Procedimientos operativos para la detección por RT-PCR en tiempo real del virus de la influenza A H1N1 (edición de 2009) (chino)
Anexo 4: RT-PCR en tiempo real Detección por PCR de los procedimientos operativos de la influenza A para el virus de la influenza H1N1 (edición de 2009) (inglés)
Anexo 5: Detección del virus de la influenza A mediante RT-PCR
Anexo 6: Aislamiento de la influenza Métodos del virus A H1N1 a partir de embriones de pollo
Apéndice 7: Método de aislamiento de células MDCK del virus de la influenza A H1N1
Apéndice 1
Nombre, sexo, edad, ocupación ※ Dirección actual, inicio de la enfermedad Fecha N.º de muestra
Especie Cantidad de muestra
(g o ml) Colección
Fecha Comentarios ※Opción: consulte el informe de enfermedades infecciosas Tarjeta.
#Opciones: A Hisopo nasofaríngeo, B Aspirado nasofaríngeo, C Líquido de lavado nasal, D Aspirado nasal, E Aspirado traqueal, F Otros (si es otro, indique lo indicado en la tabla).
Personal de recolección: Unidad de recolección (sellado):
Apéndice 2
Nombre, sexo, edad, ocupación※, dirección actual, fecha de inicio#< / p>
Cantidad de muestra*
(g o ml) de recolección
Fecha comentarios ※Opción: consulte la boleta de calificaciones de enfermedades infecciosas.
#Opciones: A Hisopo nasofaríngeo, B Aspirado nasofaríngeo, C Líquido de lavado nasal, D Aspirado nasal, E Aspirado traqueal, F Otros (si es otro, indique lo indicado en la tabla).
*Cantidad de ejemplares: Si hay varios paquetes del mismo ejemplar, por favor indíquelo.
Rellenar el formulario: Plazo de entrega de la muestra: Unidad (sellada):
Anexo 3
Procedimientos operativos para la detección por RT-PCR en tiempo real de gripe A (H1N1).
Traducción al chino (consulte también el texto original en inglés)
Nota: consulte las instrucciones de establecimiento del sistema proporcionadas por el proveedor del kit. El sistema en estas regulaciones es solo para referencia.
Procedimientos de prueba RTPCR en tiempo real de la influenza porcina de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. (edición de 2009)
La propiedad de este procedimiento pertenece a los Centros para el Control de Enfermedades y su uso está autorizado. por laboratorios de salud pública en situaciones de emergencia. Esta disposición no podrá utilizarse para actividades comerciales ni con fines lucrativos.
1. Descripción general
(1) Premisa
Este programa se basa en el dominio básico del método rRT-PCR.
(2) Principio experimental
La solución para la detección cuantitativa por fluorescencia RTPCR en tiempo real de la influenza porcina es utilizar un conjunto de cebadores oligonucleotídicos y muestras respiratorias TaqMan & reg o in vitro. Cultivos Sondas, detección cualitativa e identificación de virus de influenza porcina. Los cebadores y sondas InfA están diseñados para detectar virus de la influenza A, los cebadores y sondas swInfA pueden detectar específicamente todos los virus de la influenza porcina A, y los cebadores y sondas swH1 pueden detectar específicamente los virus del subtipo H1 de la influenza porcina. Este experimento se utiliza para detectar muestras respiratorias de casos sospechosos de infección por influenza porcina que sean positivas para influenza A.
(3) Condiciones de uso
RT-PCR cuantitativa en un solo paso 96 -Sistema de circulación térmica de placa de pozo.
(4) Requisitos de bioseguridad
El procesamiento de las muestras deberá realizarse en el laboratorio de bioseguridad correspondiente.
(5) Requisitos de muestra
1. Muestras del tracto respiratorio
Líquido de lavado broncoalveolar, aspirado traqueal, esputo, líquido o hisopo de lavado nasofaríngeo u orofaríngeo. La parte superior del hisopo utilizado en las muestras de hisopo debe estar hecha de un material artificial como poliéster o poliéster, y el mango debe estar hecho de aluminio o plástico. No se recomienda utilizar hisopos de algodón con punta de algodón y mangos de madera. No se recomienda tomar muestras con hisopo de alginato de calcio.
2. Criterios de exclusión
1) Muestras no almacenadas a 2-4°C (≤4 días) o -70°C o menos.
2) Otras muestras inapropiadas no enumeradas anteriormente.
(6) Extracción de ácidos nucleicos
La eficiencia de amplificación de la RT-PCR depende de la calidad y cantidad del ARN molde de la muestra. La operación de extracción de ARN debe utilizarse para experimentos con muestras después de calificar la pureza del ácido nucleico.
Los protocolos comerciales incluyen el kit de extracción de ARN viral QIAAMP & Reg; el kit Mini Reg Reg (QIAGEN), el kit de aislamiento de ARN compacto Pure MagNA de Roche, el kit de aislamiento de ARN LC MagNA Pure II, el kit de purificación de ácido nucleico total MagNA de Roche, en ARN altamente puro que se puede extraer en los procedimientos operativos recomendados.
(7) Descargo de responsabilidad: Los nombres de los fabricantes mencionados son solo ejemplos y no significan que estén respaldados por los CDC.
2. Materiales experimentales
(1) Reactivos
1, kit de sonda de RT-PCR cuantitativa de fluorescencia de un solo paso;
2. .Agua destilada molecularmente estéril (libre de RNasa y DNasa);
3. Cebadores directos e inversos (40 μm);
4. Sonda con doble etiqueta (10 μm);
5.
(2) Suministro
1. Marcador de laboratorio;
2. Rejilla para tubos de microcentrífuga, tubo de reacción PCR de 0,2 ml de 96 pocillos; p>3. Pipetas ajustables y cabezales de filtro de 20 μl y 200 μl;
Placa de tubo de reacción de PCR de 4,0,2 ml;
5. Placa de cubierta de reacción ligera;
6. . Tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, estéril y libre de nucleasas;
7. Guantes desechables sin polvo.
(3) Instrumentos y equipos
1. Microcentrífuga;
2. Oscilador Vortex
3. Sistema de detección de cuantificación por PCR, que incluye placa de reacción de ciclo térmico de 96 pocillos.
3. Procedimientos operativos
(1) Preparación
1. Evitar la contaminación de la muestra
Debido a la detección de 5' nucleasa fluorescente. sensibilidad, se debe prestar especial atención a la generación de falsos positivos. Se recomiendan los siguientes métodos de prevención de la contaminación:
1) Usar áreas separadas para la preparación experimental y la extracción de ácido nucleico;
2) Equipos especiales (como pipetas, microcentrífugas) y consumibles (como como tubos de microcentrífuga y puntas de pipeta) se utilizan para la preparación experimental y la extracción de ácido nucleico;
3) Después del experimento, use ropa de trabajo limpia y guantes nuevos desechables sin polvo;
4) Cambiar los guantes entre diferentes operaciones de muestra y en caso de sospecha de contaminación;
5) Las tapas de los reactivos y los tubos de reacción deben estar cerrados lo más posible.
2.Preparación del instrumental
La mesa de trabajo, las pipetas y las centrífugas deben limpiarse y purificarse con detergente, como lejía al 5%, "DNAzap" o "RNase away® reg" para reducir el riesgo de contaminación cruzada de ácidos nucleicos.
3. Preparación de los reactivos
Nota: Durante la prueba, mantenga todos los reactivos en plataformas de hielo a baja temperatura.
1) Cebadores y sondas
(1) Descongelar los cebadores y sondas congelados empaquetados (las sondas descongeladas se pueden almacenar en un lugar oscuro a 2-8°C como máximo 3 meses , no congele ni descongele repetidamente la sonda);
(2) Agite los cebadores y las sondas;
(3) Centrifugue los cebadores y las sondas momentáneamente y luego colóquelos en el En la plataforma de hielo.
2) Reactivos para 2) RT-PCR en tiempo real
(1) Coloque la mezcla maestra y la enzima en la plataforma de hielo;
(2) Derretir la mezcla de reacción 2X;;
(3) Mezclar la mezcla de reacción 2X; darle la vuelta;
(4) Centrifugar inmediatamente la mezcla de reacción 2X y la enzima y colóquelo en la plataforma de hielo.
4. Detectar cada paso de la RT-PCR.
1) Se detectaron extractos de ARN con cebadores y sondas: INFA, SWF Lua, SWE H1 (SWH 1) y RNaseP (RP). Los cebadores y sondas RNaseP se dirigen al gen RNaseP humano y, por lo tanto, sirven como controles positivos internos para los ácidos nucleicos humanos.
2) Establecer controles sin plantilla (NTC) y controles de plantilla positivos (PTC) para todos los cebadores y sondas incluidos en cada proceso.
3) El control de calidad de muestras humanas (HSC) proporciona un control de calidad negativo secundario para confirmar la integridad del proceso de extracción de ácidos nucleicos y de los reactivos.
5. Configure la reacción
Mezcle bien la mezcla de detección de reacción y luego agréguela a la placa de 96 pocillos. Luego, se añaden agua y ácido nucleico extraído o control de plantilla positivo (PTC) a las reacciones y controles experimentales apropiados.
1) Etiquetar un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada cebador y sonda.
2) Determinar el número de reacciones (n) para cada reacción establecida; Teniendo en cuenta los errores de adsorción y reacción de NTC, PTC, HSC, es necesario preparar el exceso de mezcla de reacción. Los detalles son los siguientes:
(1) Si el número de muestras (n) varía de 1 a 14, entonces n = n+1;
(2) Si el número de muestras (N) es mayor que 15, incluido el control, entonces N=n+2.
3) Master Mix: Calcula la cantidad de cada reactivo añadido a cada mezcla de reacción cebador/sonda. El cálculo es el siguiente:
*Consulte las instrucciones de configuración del sistema proporcionadas por el proveedor del paquete.
4) Después de agregar agua, sople hacia arriba y hacia abajo para mezclar la mezcla de reacción de manera uniforme sin agitar.
5) Centrifugar durante 5 segundos para recoger la mezcla en el fondo del tubo de ensayo, y luego colocar el tubo de ensayo sobre la plataforma de hielo.
6) Preparar un plato en forma de plato; tubo de reacción o placa de 96 pocillos y colóquelo en la plataforma de hielo;
7) Aspire 20 μl de cada mezcla maestra en cada pocillo y proceda en secuencia en cada fila, como se muestra en la siguiente figura:
Ejemplo de configuración experimental:
Ejemplo de muestra experimental:
Nota: antes de agregar cualquier muestra, se debe realizar un control de plantilla negativo (NTC) (columna 1). agregado para probar la contaminación en la mezcla maestra. Se debe agregar HSC después de la muestra que se va a analizar (columna 11) para verificar si hay contaminación cruzada durante la preparación o adición de la muestra. Se debe agregar un control de plantilla positivo (PTC) después de todas las muestras y un control de plantilla negativo (NTC).
8) Antes de mover la placa de cultivo al área de tratamiento de ácidos nucleicos, realice la reacción NTC en la primera columna de la placa de reacción en el área de configuración experimental. Como se mencionó anteriormente.
9) Pipetear 5μl de agua libre de nucleasas en el pocillo de NTC y tapar el pocillo de NTC.
10) Cubrir la placa de reacción y trasladarla al área de procesamiento de ácidos nucleicos.
11) Agite el tubo de ensayo que contiene la muestra durante 5 segundos y centrifugue brevemente durante 5 segundos.
12) Coloque la muestra de ácido nucleico extraída en una plataforma de hielo;
13) Como se mencionó anteriormente, las muestras se deben agregar en columnas y se deben pipetear 5 μl de la primera muestra en todos los pocillos marcados con esta muestra (muestra "S1" como se muestra en la tabla anterior). Las puntas deben reemplazarse entre diferentes muestras.
14) El orificio después de agregar la muestra debe estar cubierto, lo que ayudará a evitar la contaminación cruzada de la muestra y también facilitará que el operador registre el proceso específico de adición de la muestra.
>15) Para evitar la contaminación cruzada, cambie los guantes si es necesario
16) Repita los pasos 13-15 para las muestras restantes
17) Agregue 5 μl de HSC; muestra a los pocillos HSC (columna 11). Cubra el orificio del HSC.
18) Finalmente, agregue 5 μl de ARN de control de plantilla positivo a todos los pocillos de PTC y cubra los pocillos de PTC.
19) Si utiliza una placa de tiras de 8 tubos, etiquete cada tira para indicar la ubicación de cada muestra (¡no etiquete la parte superior del tubo de reacción!). Centrifugue el tubo brevemente durante 10 a 15 segundos y luego colóquelo sobre una rejilla para hielo. Si utiliza una placa de cultivo, centrifugue a 500 g durante 30 segundos a 4 °C y colóquela en una rejilla para hielo.
6.Condiciones de amplificación RT-PCR
El sistema de reacción es de 25ul y las condiciones de reacción son las siguientes:
Nota: La señal de fluorescencia (FAM) debe estar a 55 grados recogidos en pasos.
*Para condiciones de amplificación específicas, consulte las instrucciones proporcionadas por el proveedor del kit.
7. Interpretación/Verificación
1) La curva de crecimiento de fluorescencia obtenida en la reacción de control negativo sonda/cebador no debe exceder la línea umbral. Si la reacción negativa de uno o más cebadores y sondas es un falso positivo, es posible que la muestra haya estado contaminada. Entonces todo el proceso experimental no es válido y el experimento se repite estrictamente de acuerdo con las reglas de los pasos.
2) En 37 ciclos o antes, las curvas de respuesta de RP de todas las muestras clínicas deben exceder la línea umbral, lo que indica que se ha amplificado una cantidad suficiente de ARN del gen de la ARNasa P humana y que la calidad de la muestra es aceptable. Sin embargo, es posible que algunas muestras no tengan resultados positivos debido a la baja cantidad de células en las muestras clínicas iniciales. Mientras tanto, las muestras obtenidas de animales/aves o mediante cultivos celulares a menudo no dan resultados o dan resultados débiles en las reacciones RP.
Si la RNasa P es negativa en todas las muestras clínicas, significa:
(1) La extracción inadecuada de ácido nucleico de materiales clínicos conduce a la pérdida de ARN en las muestras clínicas o a la contaminación residual de los inhibidores de RT-PCR;
(2) No hay suficientes células humanas para realizar pruebas;
(3) Desarrollo e implementación de métodos inadecuados;
(4) Reactivos e instrumentos.
En el grupo HSC dentro de los 40 ciclos, las curvas de crecimiento de fluorescencia de las sondas InfA, swFluA y swH1 no deben exceder la línea umbral. Si la curva de crecimiento de cualquier sonda específica de influenza excede la línea umbral, se encuentran disponibles las siguientes explicaciones:
(1) Puede deberse a la contaminación del reactivo de extracción de ARN. Asegúrese de que los reactivos de extracción de ARN sean correctos antes de experimentar.
(2) La contaminación cruzada ocurre durante 2) la extracción de ARN o la adición de muestras. Repita el experimento estrictamente de acuerdo con los requisitos de los procedimientos operativos.
(3) Antes de los 40 ciclos, las reacciones INFA, SWNFA, SWH1 y RP de la reacción PTC deberían mostrar resultados positivos. Si no se produce el resultado positivo esperado, se considera inválido y el experimento debe repetirse estrictamente de acuerdo con los procedimientos operativos. Determine la causa del fallo de reacción del PTC, modifique y registre la causa del error y el plan de cambio. Se acabó el uso de reactivos PTC que no producen los resultados esperados.
(4) Cuando todos los productos de control de calidad cumplen con los requisitos, si la curva de crecimiento de la reacción InfA cruza la línea umbral dentro de 40 ciclos, la muestra se considera positiva para el virus de la influenza A. Si el virus de la influenza A es positivo, Univ SW y/o SW H1 también pueden ser positivos. Si la curva de crecimiento inversa de InfA y las reacciones específicas de subtipo (swInfA y swH1) cruza la línea umbral dentro de 40 ciclos, la muestra se considera positiva para el virus de la influenza porcina A/H1. Si una muestra es positiva solo para InfA y un subtipo, o solo para InfA, comuníquese con los CDC para obtener más orientación.
(5) Partiendo de la premisa de que todos los productos de control de calidad cumplen con los requisitos, si todas las reacciones InfA de la muestra a analizar son negativas dentro de 40 ciclos, la muestra se considera negativa.
8. Restricciones y regulaciones
1) Los experimentadores deben estar capacitados en procedimientos operativos y análisis de resultados de pruebas antes de la operación real, y solo pueden realizar experimentos después de que sean competentes.
2) Cuando el tamaño de la muestra es insuficiente, pueden producirse resultados falsos negativos, posiblemente debido a una recolección, transporte o manipulación inadecuada.
3) Si hay demasiadas plantillas de ADN/ARN en la reacción, también pueden producirse falsos negativos. Si se inhibe la reacción RP de la muestra, el ARN extraído se puede diluir 2 veces o más (por ejemplo, 1:10 o 1:100) para repetir el experimento.
9. Comentarios
Los cebadores y sondas se muestran en la versión P7 en inglés.
Anexo 4
Procedimientos operativos para la detección e identificación por RT-PCR en tiempo real del virus de la influenza A (H1N1).
(Versión en inglés)
Anexo 5
Detección por RT-PCR del nuevo virus de la influenza A H1N1
1. >
Analizar las muestras recolectadas de casos sospechosos para detectar el virus de la influenza A H1N1 y excluir el virus de la influenza estacional H1N1.
2. Cebadores NIC nombre del cebador base composición objetivo tamaño del fragmento comentarios flu afula-M-f 30 ttctaaccgagggtcgaaacg 235 BP cebador de detección universal Flua-M-r 264 aaaggcgtctacgctgcag h 1hah 65 438+0f 1147 aagagcacatatgccat 527 BP h 1n 1 Universal Primer h 1r 1r 6543868 ACTGGACTCTGCTGGAAC 327 BP Cebador de detección del subtipo H1N1 del virus de la influenza estacional humana h 1HA r 1094 aatgaaccggcaatgtcc SWH 1HA-1SW-h 1F. 786 aataacattagacacactgg 153 BP Influenza A virus primer SW-h 1n 1r 920 aggctgtttatrgcac RNase F agattgga CCT GCG. AGC G tiene aproximadamente 80 pb, lo que coincide con el cebador RnaseP en PCR en tiempo real.
CGG CTG TCT CCA CAA GT tres. Materiales e Instrumentos.
1. Kit de extracción de ARN qiagen rneasy mini kit (número de catálogo 74104)
2. β-mercaptoetanol (número de lote de β-mercaptoetanol Sigma 062k0115)
3.70 % de etanol
4. Kit de RT-PCR: kit de RT-PCR de un solo paso de QIAGEN (número de catálogo 210212)
5. Inhibidor de ribonucleasa (número de catálogo de Promega N2111)
6. Detección de cebador
7.Tubo de centrífuga Axygen de 1,5 ml, n.º de catálogo: MCT-150-C
8.Tubo de PCR Axygen de 0,2 ml, número de catálogo : PCR-02-C.
9. Agujas Axygen de 10 μl, 100 μl, 200 μl y 1000 μl con elementos filtrantes.
Muestreador de 10, 10 μl, 100 μl, 200 μl, 1000 μl
Centrífuga 11, velocidad 14K ajustable;
12, Mezclador Vortex:
13, Cabina de seguridad biológica: Cabina de seguridad biológica de nivel 2.
14. Instrumento de PCR:
15. Agarosa: agarosa biowest distribuida por Genetech (Shanghai) Co., Ltd., número de lote 101685.
16. Colorante de ácido nucleico:
17. Solución de electroforesis: 5×TBE tampón de electroforesis número de catálogo 9009032718. Tanques de electroforesis y equipos de electroforesis.
IV.Pasos experimentales
(1) Extracción de ARN
1 Dispensar la solución RLT según el número de muestras: Sacar la solución RLT del. kit y alícuota en tubos de centrífuga de 1,5 ml, 500 μl por tubo (operado en el área de preparación del sistema).
2. Agregue 100 μl de líquido de muestra (hisopo nasal, hisopo de garganta, derrame pleural, etc.) o cultivo de virus (líquido alantoideo de embrión de pollo o líquido de cultivo celular) e inyéctelo en el RLT en el líquido de la cabina de bioseguridad. en el tubo y mezclar bien.
3. Añadir 5μL de β-mercaptoetanol a cada tubo, mezclar y luego añadir 600μL de etanol al 70% y mezclar bien.
4. Saque el tubo de recolección de 2 ml con columna de filtro del kit, abra el paquete y etiquételo. Agregue 600 l de la solución mezclada en el paso (3) a la columna de filtro, centrifugue a 65438 ± 02000 rpm durante 65438 ± 05 s y deseche la solución centrifugada en el tubo de recolección.
5. Vuelva a colocar la columna de filtro en el tubo de recolección, succione toda la mezcla restante en el paso (3) en la columna de filtro a una velocidad de 12.000 rpm, centrifugue durante 15 segundos y deseche la centrífuga.
6. Agregue 700 μl de solución de tampón de lavado rw 1 a la columna de filtro y centrifugue a 12000 rpm durante 15 segundos.
7. Saque un tubo de recolección limpio de 2 ml del kit QIAGEN RNeasy Mini, mueva la columna de filtro centrífugo a un nuevo tubo de recolección, agregue 500 μl de solución tampón de lavado RPE, 12000 rpm y centrifugue durante 15 segundos.
8. Deseche el líquido de la centrífuga en el tubo de recolección, luego agregue 500 μL de solución tampón de lavado RPE a la columna de filtro y centrifugue a 13000 ~ 14000 rpm durante 2 minutos.
9. Mueva la columna de filtro a un tubo eppendorf limpio de 1,5 ml, agregue 30 ~ 50 μl de agua libre de ARNasa a la columna de filtro y déjela reposar a temperatura ambiente durante 1 ~ 3 minutos.
10. Centrifugar a 12.000 rpm durante 1 minuto. Recoger el líquido centrifugado para obtener el ARN viral extraído inmediatamente o almacenarlo por debajo de -20°C.
Nota: Añadir 44 ml de etanol absoluto entre usos del tampón RPE.
(2) Preparación del sistema de reacción
1. Diseño experimental:
Detección de ARN de muestra
Parámetros de control de calidad:
p>
Control negativo: agua estéril (al extraer ARN de la muestra, extraer agua estéril al mismo tiempo que la muestra.
)
Control positivo: ARN viral conocido
2. Preparación del sistema de reacción de PCR (preparar la solución de reacción en el área de preparación del sistema)
1) Según el siguiente tabla Añadir reactivos:
Volumen de componente del sistema de reacción de PCR (μL) Agua libre de RNasa
5×Tampón RT-PCR 11,9×n
5× n Mezcla dntp de 10 mm 1 × mezcla de enzima nen 1 × inhibidor de nRNA se 0,1 × n Cebador aguas arriba 0,5 × n Cebador aguas abajo 0,5 × nTotal 20 × Determine el número de reacciones para cada reacción establecida (n = número de tubos de PCR a realizar, incluidas las reacciones negativas Teniendo en cuenta el control negativo sin plantilla, el control positivo y el error, el exceso de mezcla de reacción debe prepararse de la siguiente manera:
(1) Si el número de muestras (n) oscila entre 1 y 14, entonces n = n+ 1;
(2) Si el número de muestras (N) es mayor que 15, incluido el control, entonces N=n+2
2) Mezclar. la solución de reacción anterior de manera uniforme y alícuota en tubos de PCR de 0,2 ml, 20 μl en cada tubo, etiquetados por separado.
3) Añadir plantilla de ARN (en el área de extracción de ácido nucleico)
Añadir la plantilla a la pajita de PCR empaquetada individualmente mencionada anteriormente. Primero agregue el tubo de control negativo (5 μL de agua estéril), luego agregue el ARN de muestra (5 μL cada tubo) y finalmente agregue el ARN de control positivo (5 μL cada tubo).
3. Reacción de RT-PCR
Mezclar uniformemente el tubo de reacción y la plantilla, centrifugar durante un breve periodo de tiempo y colocarlos en una máquina de PCR para RT-PCR.
Amplificación, el programa de reacción es el siguiente: temperatura (°C), tiempo número de ciclo 60℃1min 1min 50℃30min 95℃15min 94℃30s 3552℃30s 72℃1min 72℃7min 65438.
1) Preparación de gel de agarosa al 2,0%: pesar 2,0g de agarosa, verterlo en una botella de vidrio resistente al calor, añadir 100 ml de solución de electroforesis (1× TBE), remover suavemente y calentar hasta obtener la agarosa. está completamente derretido. Cuando la temperatura del gel de agarosa baje a aproximadamente 50 ~ 60 °C, agregue el colorante de ácido nucleico y revuelva suavemente (sin burbujas). Cuando la temperatura del gel baje a aproximadamente 50°C, viértalo en la placa de fabricación de gel e inserte el peine de electroforesis. Después de que el pegamento se haya solidificado por completo (entre 30 y 60 minutos aproximadamente), saque el peine.
2) Coloque el gel de electroforesis preparado en el tanque de electroforesis (el extremo con el orificio del peine está en el cátodo), vierta la solución de electroforesis (1 × TBE) para empapar la superficie del gel.
3) Tome 10 µL de productos de PCR, agregue 2 µL de tampón de carga (6× tampón de carga), mezcle bien y luego agréguelo al pocillo del gel de electroforesis (primero agregue 5 µl de marcador (DL ) -2000), luego agregue el producto de PCR de muestra en secuencia, luego agregue el producto de control negativo y finalmente agregue el producto de control positivo).
4) El voltaje de la electroforesis es de 100 V y los resultados se verán después de unos 30 ~ 40 minutos.
5) Coloque el gel de electroforesis en el sistema de imágenes de gel para observar los resultados y tomar fotografías.
5. Juicio de resultados
Cuando el sistema está establecido, es decir, cuando los límites Yin y Yang son normales, el significado de cada cebador es el siguiente: Muestra de cebador de PCR 1 muestra. 2 Muestra 3 Muestra 4 Muestra 5 Muestra 6 flua _ +++/-h 1HA _+/-huh 1HA _ _++_+/-SWH 1HA-1 _ _+/-RNA sep +++++ El resultado es no influenza
Subtipo no H1N1 humano subtipo H1N1 estacional subtipo porcino virus de la influenza H1N1.
Enviar al Centro Nacional de Influenza para revisión. Las muestras enviadas al Centro Nacional de Influenza para su análisis no son de origen humano/hay muy pocas células en las muestras/hay un problema con el experimento o instrumento.