Contenido de la tecnología de bioingeniería
Después de comprender que el código genético es la transcripción y expresión del ARN, los biólogos todavía quieren intervenir en la herencia de los organismos a nivel molecular. En 1973, el profesor Cohen de la Universidad de Stanford en Estados Unidos cortó diferentes genes de resistencia a los medicamentos de dos plásmidos y los unió en el mismo plásmido. Cuando este plásmido híbrido ingresa a E. coli, ésta se vuelve resistente a ambos fármacos y su progenie tiene propiedades antibacterianas duales. Los experimentos de recombinación de Cohen abrieron la puerta a la ingeniería genética.
La tecnología de ADN recombinante es la tecnología central de la ingeniería genética. La recombinación, como sugiere el nombre, es una recombinación que utiliza el material genético de un organismo donante o un gen sintético, lo corta in vitro y lo conecta a un portador adecuado para formar una molécula de ADN recombinante y luego introduce la molécula de ADN recombinante. en la célula receptora o en el organismo receptor. En el cuerpo, los organismos genéticamente modificados se construyen para que puedan expresar ciertas características de otro organismo de acuerdo con el modelo diseñado de antemano por los humanos. (1) Gen objetivo
La ingeniería genética es un trabajo creativo con un propósito deseado, y su materia prima es el gen objetivo. El llamado gen diana se refiere a un fragmento de ADN obtenido mediante métodos artificiales que cumple con los requisitos del diseñador. En condiciones apropiadas, el gen objetivo se expresará en forma de proteína, logrando así el objetivo del diseñador de modificar los rasgos biológicos.
(2) Portador
Generalmente, el gen de interés no puede ingresar directamente a otra célula biológica y debe combinarse con un portador específico para ingresar de manera segura a la célula receptora. Los vectores utilizados actualmente comúnmente incluyen plásmidos, fagos y virus.
Un plásmido es una molécula de ADN circular que se encuentra en las células de la mayoría de las bacterias y de algunos eucariotas, situada en el citoplasma. Muchos plásmidos contienen genes que pueden ser necesarios en determinadas circunstancias.
El bacteriófago es un tipo de virus que infecta específicamente a las bacterias. Consiste en una cubierta proteica y ácido nucleico en el centro. Después de que los fagos infectan a las bacterias, inyectan ADN en las bacterias y lo utilizan como plantilla para copiar moléculas de ADN, sintetizar proteínas y finalmente ensamblarse en nuevos fagos. Cuando la bacteria muere y se rompe, se libera una gran cantidad de fagos para infectar al siguiente objetivo.
Los plásmidos, fagos y virus son similares en el sentido de que pueden inyectar sus propias moléculas de ADN en las células huésped y mantener las moléculas de ADN intactas, lo que los convierte en vectores adecuados para transportar genes diana. Por tanto, los vectores en ingeniería genética son esencialmente moléculas de ADN especiales.
(3) La ingeniería genética con enzimas herramientas requiere un conjunto de herramientas para aislar el gen objetivo del organismo y luego seleccionar un vector adecuado para conectar el gen objetivo al vector. Las moléculas de ADN son muy pequeñas, sólo 20 Angstroms (10-10 metros) de diámetro. La ingeniería genética es en realidad una especie de "ingeniería ultraminiatura" que requiere herramientas especializadas para cortar, coser y transportar ADN.
En 1968, los científicos extrajeron por primera vez enzimas de restricción de E. coli. La característica más importante de las endonucleasas de restricción es su fuerte especificidad, que pueden reconocer secuencias de nucleótidos específicas en el ADN y cortar moléculas de ADN en líneas tangentes específicas. Desde la década de 1970, se han aislado y extraído más de 400 enzimas de restricción. Con él, se pueden cortar largas cadenas de moléculas de ADN a voluntad. La tabla 4-3 muestra los sitios de reconocimiento de algunas enzimas de restricción.
Del año 65438 al 0976, científicos de cinco laboratorios descubrieron y extrajeron una enzima casi simultáneamente con la ADN ligasa. Desde entonces, la ADN ligasa se ha convertido en el "adhesivo molecular" que "pega" los genes. La recombinación típica de ADN incluye cinco pasos:
(1) Obtención del gen diana
Actualmente existen tres métodos principales para obtener el gen diana: transcripción inversa, aislamiento directo del genoma celular y Sintético.
La transcripción inversa es un método de obtención del gen diana mediante la transcripción inversa del ARNm. Ahora la gente ha utilizado este método para sintetizar genes de globina de conejo, pato y humana y genes de queratina de plumas.
El método de la escopeta se utiliza a menudo para aislar directamente el gen objetivo del genoma de la célula. Debido a que este método es como dispararle a un pájaro con una escopeta, también se le llama método de la escopeta. El método de escopeta es simple, conveniente y económico para aislar el gen objetivo. Mediante este método se han aislado con éxito genes de muchos virus, procariotas y algunos eucariotas.
La síntesis química de genes diana es una nueva tecnología desarrollada en la década de 1970. Los genes diana se pueden sintetizar en poco tiempo mediante síntesis química. Los científicos han sintetizado sucesivamente genes que codifican proteínas para la somatostatina, la insulina y el interferón humanos.
(2)2) Recombinación in vitro de moléculas de ADN
La recombinación in vitro consiste en conectar el vector y el gen diana. Por ejemplo, cuando se utilizan plásmidos como vectores, es necesario seleccionar enzimas de restricción adecuadas para cortar el gen objetivo y el vector, y luego utilizar la ADN ligasa para conectar los desoxinucleótidos en ambos extremos del corte. Luego, el gen diana se inserta en el ADN plasmídico y se recombina para formar una nueva molécula de ADN circular (molécula de ADN híbrida).
(3) Importación 3) ADN recombinante
Después de que el gen objetivo se carga en el vector, es necesario introducirlo en la célula receptora. Existen muchos métodos de introducción, incluyendo transformación, transducción, microinyección, bombardeo de partículas, electroporación, etc. La transformación y la transducción se utilizan principalmente en células procariotas como bacterias y células eucariotas inferiores como la levadura, mientras que otros métodos se utilizan principalmente en células animales y vegetales superiores.
(4) Detección de células receptoras
Debido a que la tasa de éxito de la recombinación del ADN no es muy alta, es necesario seleccionar células transformadas con éxito entre muchas células para la recombinación del ADN. Encuentre señales específicas con anticipación para demostrar si la importación fue exitosa o no. Por ejemplo, a menudo utilizamos antibióticos para demostrar el éxito de la introducción.
(5) Expresión génica
Una vez que el gen diana se introduce con éxito en la célula receptora, la información genética que transporta debe expresarse mediante la síntesis de una nueva proteína, cambiando así la función de la célula receptora. Para expresar el gen de interés en las células receptoras, se deben cumplir algunas condiciones. Por ejemplo, el gen diana utiliza los ribosomas de la célula receptora para sintetizar proteínas, por lo que el gen diana debe contener un fragmento funcional que pueda iniciar el trabajo de los ribosomas de la célula receptora.
Estos cinco pasos representan el proceso de funcionamiento general de la ingeniería genética.
No ha pasado mucho tiempo desde que la gente dominó la tecnología de ingeniería genética, pero se han logrado muchos resultados prácticos. Como núcleo de la biotecnología moderna, la ingeniería genética desempeñará un papel cada vez más importante en la producción y la práctica social. No existe una definición ni un alcance unificados para la ingeniería celular. En general, se cree que la ingeniería celular es una manipulación genética realizada a nivel celular utilizando tecnología de cultivo celular basada en los principios de la biología celular y la biología molecular. La ingeniería celular se puede dividir a grandes rasgos en ingeniería cromosómica, ingeniería citoplasmática e ingeniería de fusión celular. 1. Tecnología de cultivo celular
La tecnología de cultivo celular es la tecnología básica de la ingeniería celular. El llamado cultivo celular es una tecnología que toma una pequeña porción de una determinada parte de un organismo biológico y la cultiva para que crezca y se divida. El cultivo celular también se llama cultivo de tejidos. En las últimas dos décadas se han realizado importantes avances teóricos en la investigación en biología celular, como el descubrimiento de la totipotencia celular, el ciclo celular y su regulación, la investigación sobre la carcinogénesis y la senescencia celular, la expresión y regulación de genes, etc. , son inseparables de la tecnología de cultivo celular.
El cultivo celular in vitro es un medio que suministra los nutrientes que necesitan células enteras animales y vegetales. Además de ser ricos en nutrientes, los medios de cultivo generalmente también contienen trazas de sustancias que estimulan el crecimiento y desarrollo celular. Generalmente, existen dos tipos de medios de cultivo, sólidos y líquidos, que sólo pueden utilizarse después de la esterilización. Además, la temperatura, la luz y la frecuencia de oscilación también son condiciones importantes que afectan la cultura.
El proceso básico del cultivo de células y tejidos vegetales implica los siguientes pasos:
El primer paso es cultivar células de partes o tejidos específicos de plantas sanas, como raíces, tallos, hojas, flores, frutos y El material de partida para el cultivo (explantes) se selecciona del polen.
El segundo paso consiste en utilizar determinados productos químicos (hipoclorito de sodio, cloruro de mercurio, alcohol, etc.) para desinfectar la superficie del explante. ) Establecer un sistema de cultivo estéril.
En tercer lugar, se forman el tejido calloso y los órganos. El tejido calloso luego se diferencia y brota, y puede inducirse aún más a formar plantas pequeñas.
Existen dos formas de cultivar células animales.
Uno se llama cultivo sin monocapa: es decir, las células no se adhieren a la pared durante el proceso de cultivo. Las condiciones son más complejas y difíciles, pero es fácil obtener una gran cantidad de células cultivadas al mismo tiempo. Este método se utiliza habitualmente para el cultivo de linfocitos, células tumorales y algunas células transformadas. Otro método de cultivo es el cultivo en monocapa: también llamado unión celular. Las células adheridas crecen en una sola capa, por lo que este método también se llama cultivo celular en monocapa. La mayoría de las células de mamíferos deben cultivarse de esta manera.
Las células animales no se pueden cultivar fuera del cuerpo. Tomando como ejemplo el cultivo de células de piel humana, los pasos principales del cultivo de células animales son los siguientes:
El primer paso es tomar una cantidad adecuada de tejido de un animal sano en condiciones estériles y cortarlo en trozos pequeños. rebanadas.
El segundo paso consiste en añadir concentraciones adecuadas de enzimas y sustancias auxiliares de la digestión para dispersar las células.
En tercer lugar, después de lavar y purificar las células dispersas, se añaden al medio de cultivo en una concentración adecuada, se cultivan a 37 °C y se subcultivan a su debido tiempo. (Figura 4-31)
En cultivo celular, a menudo usamos una palabra: clonación. La palabra clon es una transliteración del inglés clon y se refiere a la reproducción asexual y a grupos celulares o grupos biológicos obtenidos mediante reproducción asexual. La clonación celular se refiere a líneas de células propagadas asexualmente. La clonación natural existe desde hace mucho tiempo en la naturaleza. Por ejemplo, los gemelos idénticos son en realidad un tipo de clonación.
En ingeniería genética existe otro método llamado clonación molecular, que fue propuesto por Cohen et al. La clonación molecular ocurre a nivel molecular de ADN. Se refiere a un clon molecular de ADN obtenido extrayendo un gen de una célula como gen exógeno, conectándolo a un vector in vitro y luego introduciéndolo en otra célula receptora para su replicación autónoma.
2. Tecnología de transferencia nuclear
Debido a que la clonación es reproducción asexual, los componentes genéticos de todos los miembros de un mismo clon son exactamente iguales, lo que favorece el mantenimiento fiel de las excelentes características de la variedad original. La gente comenzó a explorar el uso de métodos artificiales para clonar animales superiores. Hay dos métodos principales de clonación de mamíferos: segmentación de embriones y transferencia nuclear. Entre ellos, el trasplante nuclear es una nueva tecnología que se desarrolló relativamente tarde pero que tiene un gran potencial.
La tecnología de transferencia nuclear pertenece a la ingeniería citoplasmática. La llamada tecnología de transferencia nuclear se refiere a la transferencia mecánica de un núcleo celular (que contiene material genético) llamado "célula donante" a otra célula sin núcleo llamada "receptor", y luego las células recombinantes se desarrollan y diferencian aún más. El principio del trasplante nuclear se basa en la totipotencia de los núcleos de las células animales.
La idea de clonar animales mediante transferencia nuclear fue propuesta por primera vez por embriólogos alemanes en 1938. A partir de 1952, los científicos utilizaron por primera vez anfibios para realizar experimentos de clonación por transferencia nuclear y, sucesivamente, obtuvieron renacuajos y ranas adultas. 65438-0963, un equipo de investigación dirigido por el profesor Tong Dizhou de mi país estudió la tecnología de transferencia nuclear de embriones de peces utilizando peces de colores como material y logró el éxito. Hasta 1995, la transferencia nuclear embrionaria ha tenido éxito en todos los mamíferos importantes, pero la transferencia nuclear de células diferenciadas en animales adultos aún no ha tenido éxito.
Durante 1996, el equipo de investigación de Ian Wilmut creó con éxito una oveja clonada, Dolly, mediante transferencia nuclear en el Instituto Roslin de Edimburgo, Reino Unido. Esta fue la primera oveja clonada del mundo resultante de un trasplante nuclear de un adulto. células somáticas de mamíferos. Figura 4-33 Diagrama esquemático de la clonación de ovejas.
No todas las células pueden utilizarse como donantes nucleares para un trasplante nuclear. Hay dos tipos de células utilizadas como donantes: células embrionarias y algunas células somáticas.
Las investigaciones demuestran que los óvulos, los ovocitos y los óvulos fecundados son células receptoras adecuadas.
En junio de 2000, la Universidad Northwest AF clonó dos "ovejas clonadas" utilizando células somáticas de cabras adultas, lo que demostró que los científicos chinos también dominaban la tecnología de vanguardia del trasplante nuclear de células somáticas de mamíferos.
La investigación sobre la transferencia nuclear no sólo tiene un importante valor científico para aclarar la totipotencia de los núcleos de las células animales y la relación entre el núcleo y el citoplasma, sino que también tiene un importante valor económico y perspectivas de aplicación en la producción ganadera.
3. Tecnología de fusión celular
La tecnología de fusión celular pertenece a la ingeniería de fusión celular. La tecnología de fusión celular es una nueva tecnología que obtiene células híbridas y cambia sus propiedades. Se refiere al proceso de fusionar artificialmente células somáticas de la misma o diferente especie en condiciones in vitro para formar células híbridas.
La fusión celular es un método importante en citogenética, inmunología celular, virología y oncología.
Los principales pasos en la fusión de células animales son:
El primer paso es la obtención de células parentales. Las células se aíslan del tejido de la muestra mediante tripsina o medios mecánicos y se cultivan en monocapa o suspensión, respectivamente.
El segundo paso es inducir la fusión. La fusión celular se realizó colocando las dos células parentales en el mismo medio de cultivo. El proceso de fusión de las células animales generalmente es: dos células están en estrecho contacto → las membranas celulares se fusionan → aparecen canales o puentes celulares entre las células → el número de puentes celulares aumenta y el área del canal se expande → dos células se fusionan en una.
Los principales pasos en la fusión de células vegetales son:
El primer paso es preparar los protoplastos parentales.
El segundo paso es inducir la fusión.
Los pasos de fusión de las células microbianas son básicamente los mismos que los de las células vegetales.
Desde la década de 1970, se han fusionado con éxito muchos tipos de células, incluidas nuevas plantas híbridas como "tomate y patata", "colza Arabidopsis" y "col champiñón". (La Figura 4-36 muestra el cultivo de plantas híbridas mediante fusión celular). Con el nivel actual de tecnología, la gente no puede fusionar muchas células distantes para cultivar individuos híbridos, especialmente células animales. Ingeniería de fermentación moderna. También conocida como ingeniería microbiana, se refiere al uso de tecnología moderna de bioingeniería para utilizar ciertas funciones específicas de los microorganismos para producir productos útiles para los humanos o para aplicar microorganismos directamente a los procesos de producción industrial. La fermentación es una función única de los microorganismos. Los humanos la reconocen desde hace miles de años y la utilizan para elaborar vino, pan y otros alimentos. En la década de 1920, la fermentación alcohólica, la fermentación de glicerol y la fermentación de propanol eran los principales métodos. El auge de la industria de los antibióticos en los Estados Unidos a mediados de la década de 1940, la producción a gran escala de penicilina y el éxito de la fermentación del ácido glutámico en Japón promovieron en gran medida el desarrollo de la industria de la fermentación.
En la década de 1970, con el rápido desarrollo de la biotecnología, como la recombinación genética y la fusión celular, la industria de la fermentación entró en la etapa de la ingeniería de fermentación moderna. No sólo produce bebidas alcohólicas, ácido acético y pan, sino que también produce una variedad de medicamentos y medicamentos para el cuidado de la salud, como insulina, interferón, hormona del crecimiento, antibióticos y vacunas. También produce materiales de producción agrícola como pesticidas naturales y bacterias. fertilizantes y herbicidas microbianos. La industria química produce aminoácidos y especias, biopolímeros, enzimas, vitaminas, proteínas unicelulares, etc.
A grandes rasgos, la ingeniería de fermentación consta de tres partes: ingeniería upstream, ingeniería de fermentación e ingeniería downstream. Los proyectos upstream incluyen la selección de excelentes plantas de semillas, la determinación de las condiciones óptimas de fermentación (pH, temperatura, oxígeno disuelto, nutrientes) y la preparación de nutrientes. La ingeniería de fermentación se refiere principalmente a la tecnología de cultivar una gran cantidad de células en tanques de fermentación y producir metabolitos en condiciones óptimas de fermentación. La ingeniería downstream se refiere a la tecnología de separación y purificación de productos del caldo de fermentación.
Los pasos de la ingeniería de fermentación generalmente incluyen:
El primer paso es la selección de cepas.
El segundo paso es la preparación y esterilización del medio de cultivo.
El tercer paso es ampliar el cultivo y la inoculación.
El cuarto paso es el proceso de fermentación.
El quinto paso es la separación y purificación.
La ingeniería de fermentación se ha utilizado ampliamente en muchos campos como la industria farmacéutica, la industria alimentaria, la agricultura, la industria metalúrgica y la protección del medio ambiente. La ingeniería enzimática se refiere al uso de enzimas, células u orgánulos con funciones catalíticas específicas, utilizando dispositivos de reacción biológica y ciertos medios técnicos para producir productos necesarios para los humanos. Es una nueva tecnología formada combinando la teoría enzimológica y la tecnología química.
La ingeniería enzimática se puede dividir en dos partes. Parte de esto es cómo producir enzimas y parte es cómo aplicarlas.
La producción de enzimas ha pasado aproximadamente por cuatro etapas de desarrollo. Originalmente, las enzimas se extraían de los intestinos de los animales. Con el desarrollo de la ingeniería enzimática, la gente utiliza cultivos de microorganismos a gran escala para obtener enzimas. Después del nacimiento de la ingeniería genética, los microorganismos productores de enzimas se transformaron mediante recombinación genética. En los últimos años ha surgido un nuevo tema candente en la ingeniería enzimática, que es la síntesis artificial de nuevas enzimas, es decir, enzimas artificiales.
El uso de enzimas también presenta algunas desventajas. Si encuentra altas temperaturas, ácidos fuertes o álcalis fuertes, perderá actividad, lo que provocará altos costos y precios. En aplicaciones prácticas, esta enzima sólo se puede utilizar una vez. La inmovilización de enzimas puede resolver estos problemas y se denomina centro de ingeniería enzimática.
A principios de los años 60, los científicos descubrieron que tras la inmovilización, la actividad de muchas enzimas no disminuía en absoluto, sino que aumentaba su estabilidad. Este descubrimiento supuso un punto de inflexión en la promoción y aplicación de enzimas y el desarrollo de la ingeniería enzimática. Hoy en día, la tecnología de inmovilización de enzimas avanza rápidamente. Se manifiesta en dos aspectos:
Uno es el método fijo. Actualmente existen cuatro métodos de fijación: método de adsorción, * * método de enlace de valencia, método de reticulación y método de inclusión.
En segundo lugar, las enzimas inmovilizadas incluyen una variedad de enzimas que pueden catalizar una serie de reacciones.
En comparación con las enzimas naturales, las enzimas inmovilizadas y las células inmovilizadas tienen ventajas obvias:
1. Pueden adoptar diversas formas, como gránulos, tubos y películas, y pueden colocarse. en el tanque de reacción para una fácil extracción y reutilización continua.
2. Se mejora la estabilidad, la actividad no se pierde fácilmente y se prolonga la vida útil.
3. Facilita la operación automatizada y realiza una producción continua controlada por computadora.
Docenas de países utilizan ahora enzimas y células inmovilizadas para la producción industrial, con productos que incluyen alcohol, cerveza, diversos aminoácidos, diversos ácidos orgánicos y productos farmacéuticos.