¿Cuáles son los problemas comunes con la electroforesis en gel de agarosa?
Bandas de ADN borrosas
Degradación del ADN: Las pruebas de electroforesis en gel de agarosa deben evitar la contaminación por nucleasas.
Tampón de electroforesis antiguo: después del uso repetido del tampón de electroforesis, la fuerza iónica disminuye, el valor del pH aumenta y la capacidad tampón se debilita, lo que afecta el experimento de electroforesis. Se recomienda cambiar el tampón de electroforesis con frecuencia.
Las condiciones de electroforesis utilizadas son inadecuadas: el voltaje no debe exceder los 20V/cm, y la temperatura
El ADN sube demasiado: se debe reducir la cantidad de ADN en el gel.
Exceso de contenido de sal en muestras de ADN: Utilice precipitación con etanol para eliminar el exceso de sal antes de la electroforesis.
Contaminación de proteínas: Utilice extracción con fenol para eliminar las proteínas antes de la electroforesis.
Migración irregular de la banda de ADN
Replegado del sitio cos del fragmento λ/hind ⅲ: el ADN5 se calentó a 65 °C durante 5 minutos antes de la electroforesis y luego se enfrió en hielo durante 5 minutos.
Las condiciones de electroforesis son inapropiadas: el voltaje de electroforesis no supera los 20 V/cm; la temperatura es < 30 °C; el tampón de electroforesis se reemplaza con frecuencia.
Desnaturalización del ADN: Diluir el ADN con tampón NaCI 20mM y no calentar antes de la electroforesis.
La banda de ADN es muy débil o está ausente
Cantidad de muestra de ADN insuficiente: aumente la cantidad de muestra de ADN, la sensibilidad de la electroforesis en gel de poliacrilamida es ligeramente mayor que la de la electroforesis en gel de agarosa; se puede reducir adecuadamente el volumen de carga.
Degradación del ADN: evita el riesgo de contaminación por nucleasas
Liberación del gel de ADN: acorta el tiempo de electroforesis, reduce el voltaje y mejora la concentración del gel.
Para el ADN teñido con EB, la fuente de luz utilizada es inapropiada: utilice una fuente de luz UV de longitud de onda corta (254 mm).
Eliminación de bandas de ADN
Pequeñas bandas de ADN fuera del gel: acorta el tiempo de electroforesis, reduce el voltaje y aumenta la concentración del gel.
Las bandas de ADN de tamaño molecular similar son difíciles de distinguir: aumentar el tiempo de electroforesis y aprobar la concentración correcta del gel.
Desnaturalización del ADN: No calentar la cadena NDA a alta temperatura antes de la electroforesis y diluir el ADN con tampón NacI 20 mM.
La cadena de ADN es muy larga y la electroforesis en gel convencional no es adecuada: análisis por electroforesis en gel pulsada.
En resumen, se deben tener en cuenta los siguientes puntos durante los experimentos de electroforesis en gel de agarosa:
1. Al preparar el sistema, los reactivos más críticos deben garantizar que aún sean efectivos o no estén contaminados: cebadores, enzimas y agua ultrapura. Será mejor que guardes estas cosas tú mismo, escribas tu nombre y las guardes, y recuerda atar una banda elástica a la hielera para que otros no toquen tu hielera ni todos los reactivos mientras hurgan en el refrigerador. De lo contrario, sus reactivos se contaminarán y será muy problemático encontrar la fuente de contaminación si el control negativo se vuelve loco. Y al configurar el sistema, preste atención a mantener limpia el área experimental. Se puede usar alcohol en aerosol con anticipación para reparar el ADN en el aire y se deben usar guantes en todo momento para evitar contaminar el sistema.
2. El sistema PCR debe ser preciso y es mejor utilizar un sistema antiguo que haya sido desarrollado por otros.
3. Si desea obtener un hermoso patrón de electroforesis, puede verter el gel al comienzo de la PCR (siempre que el tiempo total de PCR sea de aproximadamente 1,5 horas y todavía esté en el laboratorio después de 1,5 horas). ). ), deje que el gel se enfríe, para que los poros del gel sean más regulares y el tamaño de los poros del gel en sí sea más regular. Si va a ejecutar el gel nuevamente al día siguiente, asegúrese de almacenar las muestras de PCR a 4 °C. Al hacerlo al día siguiente, se recomienda enfriar el pegamento durante unos 25 minutos.
4. Al cargar muestras para electroforesis en gel de agarosa, se recomienda utilizar una pistola para cargar las muestras. No solo la velocidad es rápida, sino que también lo es la velocidad de carga de las muestras en los pocillos del gel. mismo. Por supuesto, es mejor elegir cabezas de armas importadas para la disposición de las armas y olvidarse de las cabezas de armas nacionales.
5. Independientemente de la frecuencia de la cámara de electroforesis, recomiendo cambiar la solución de electroforesis cada vez que se realiza la electroforesis en gel de agarosa para evitar la aparición de bandas en forma de "".