¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la electroforesis en agarosa?
El gel de agarosa puede distinguir fragmentos de ADN que difieren en aproximadamente 100 pb. Aunque su resolución es menor que la del gel de poliacrilamida, es fácil de preparar, tiene un amplio rango de separación y es particularmente adecuado para separar grandes fragmentos de ADN. El rango de ADN separado por gel de agarosa común es de 0,2 a 20 kb, y la electroforesis por pulsos puede separar fragmentos de ADN de hasta 10 7 pb.
Características del gel de agarosa
El agar natural (agar) es un polisacárido, compuesto principalmente por agarosa (alrededor de un 80%) y gel de agar. La agarosa es una sustancia neutra compuesta de galactosa y sus derivados y no tiene carga, mientras que el gel de agar es un polisacárido fuertemente ácido que contiene grupos sulfato y carboxilo. Debido a que estos grupos están cargados, pueden producir una fuerte electroósmosis bajo la acción de un campo eléctrico. Los grupos sulfato pueden interactuar con algunas proteínas, afectando así la velocidad de la electroforesis y el efecto de separación. Por tanto, la agarosa se utiliza actualmente ampliamente como soporte de electroforesis para electroforesis en placas. Sus ventajas son las siguientes.
(1) La electroforesis en gel de agarosa es sencilla y rápida, y las muestras se pueden electroforetizar sin tratamiento previo.
(2) El gel de agarosa tiene una estructura uniforme, un alto contenido de agua (aproximadamente 98% ~ 99%) y es similar a la electroforesis libre. La corriente de difusión de la muestra es relativamente libre y la adsorción de la misma. La muestra es mínima, por lo que el patrón de electroforesis es claro. Alta resolución y buena repetibilidad.
(3) La agarosa es transparente y no tiene absorción de rayos UV. El proceso de electroforesis y los resultados pueden detectarse directamente y determinarse cuantitativamente mediante luz UV.
(4) Después de la electroforesis, la zona es fácil de teñir y la muestra es fácil de eluir, lo cual es conveniente para la determinación cuantitativa. Prepare una película seca para almacenamiento a largo plazo.
Actualmente, la agarosa se utiliza habitualmente como soporte de electroforesis para la separación de proteínas e isoenzimas. Combinando la electroforesis en agarosa con la inmunoquímica, se desarrolló una técnica de inmunoelectroforesis que puede identificar sistemas complejos que no pueden identificarse mediante otros métodos. Gracias al establecimiento de la tecnología ultramicro, se pueden detectar 0,1 ug de proteína.
La electroforesis en gel de agarosa también se utiliza habitualmente para separar e identificar ácidos nucleicos, como la identificación del ADN y el mapeo de enzimas de restricción del ADN. Este método es fácil de operar, tiene equipos simples, tamaño de muestra pequeño y alta resolución, y se ha convertido en uno de los métodos experimentales comúnmente utilizados en la investigación de ingeniería genética.