Dirección breve del artículo sobre cultivo de tejidos vegetales

Título del artículo: Sobre los factores y contramedidas del pardeamiento en el cultivo de tejidos vegetales

Resumen: Este artículo se centra en el fenómeno común del pardeamiento en el cultivo de tejidos vegetales y analiza en detalle su mecanismo y su influencia. factores y proponer las contramedidas correspondientes, proporcionando cierta base teórica y práctica para la investigación y producción científica.

Palabras clave: cultivo de tejidos vegetales, pardeamiento, contramedidas

Actualmente, los problemas de pardeamiento son frecuentes en muchos procesos de cultivo de tejidos vegetales. El pardeamiento ocurre principalmente en explantes, pero también ocurre a menudo en el subcultivo de callos de plantas, cultivos de células en suspensión y aislamiento y cultivo de protoplastos. Los productos de pardeamiento no sólo dañan los explantes, las células, los medios de cultivo, etc., sino que también inhiben muchas enzimas, afectando así el crecimiento y la diferenciación de los materiales cultivados e incluso provocando la muerte en casos graves. Este artículo analiza los factores que influyen, los mecanismos y las medidas preventivas del fenómeno del pardeamiento en el cultivo de tejidos vegetales. Tiene una importancia práctica muy importante para nuestra investigación científica o producción industrial, incluido el cultivo de tejidos vegetales, protoplastos, células en suspensión y órganos vegetales.

1 Factores que afectan al pardeamiento

Los factores que afectan al pardeamiento en el cultivo de tejidos vegetales son complejos y varían dependiendo del tipo, genotipo, ubicación del explante y estado fisiológico de la planta, el grado. El grado de dorado también varía.

1.1 Especies de plantas y genotipos Diferentes plantas y diferentes genotipos determinan diferentes grados de pardeamiento. En el cultivo de tejidos, la dificultad de oscurecer una variedad puede estar relacionada con la diferencia en el contenido de polifenoles y la actividad de la polifenol oxidasa (PPO) en la variedad.

1.2 Sitio del explante y estado fisiológico. El grado de pardeamiento es diferente dependiendo del sitio y estado fisiológico del explante. Al mismo tiempo, el grado de pardeamiento de los explantes en diferentes etapas y edades durante el cultivo es. también diferente.

1.3 Componentes del medio Las sales inorgánicas, la concentración de sacarosa, los niveles hormonales, etc. de los componentes del medio tienen un impacto especialmente importante en el grado de pardeamiento. Además, su valor de pH también está estrechamente relacionado con el grado de dorado.

1.4 Condiciones de cultivo Si la temperatura es demasiado alta o la luz es demasiado fuerte, se puede acelerar el oscurecimiento del tejido cultivado. Las condiciones ambientales adversas pueden provocar la muerte celular programada, y la temperatura es el principal factor que induce la muerte programada [1].

2 Mecanismo de pardeamiento

2.1 Pardeamiento no enzimático

El pardeamiento no enzimático es causado por células que se ven afectadas por estrés u otras condiciones adversas Muerte celular programada o La muerte celular natural, es decir, el fenómeno de pardeamiento de la necrosis, no implica la producción de sustancias fenólicas. Xu Zhenbiao et al. [1] transfirieron tejido de callo de crecimiento normal a un medio que contenía NaCl. Se produjo un oscurecimiento alrededor del tejido, especialmente en la parte en contacto con el medio, pero no se observó material de oscurecimiento difuso en el medio. Este fenómeno también puede ocurrir cuando la temperatura aumenta y el tiempo de almacenamiento es demasiado largo. Sin embargo, este oscurecimiento ya no se producirá si se toman las medidas adecuadas o si el callo se adapta al entorno estresante [3].

2.2 Pardeamiento enzimático

Actualmente, se cree que el pardeamiento en el cultivo de tejidos vegetales es causado principalmente por pardeamiento enzimático, y el pardeamiento de los materiales de cultivo es causado principalmente por los fenoles secretados por la herida. . causado por compuestos similares [4]. El pardeamiento enzimático es como una reacción enzimática general, y deben estar presentes tres condiciones para que ocurra, a saber, enzima, sustrato y oxígeno. Las enzimas que causan el pardeamiento incluyen la polifenol oxidasa (PPO), la peroxidasa (POD), la fenilalanina amoníaco liasa, etc. A juzgar por el grado de oscurecimiento de las plántulas de tubo de ensayo y la actividad de la PPO durante el cultivo y subcultivo inicial, se demuestra que el nivel de actividad de la PPO es la clave para provocar el oscurecimiento de los materiales de cultivo. Los sustratos de las enzimas que provocan el pardeamiento son principalmente compuestos fenólicos, que se pueden dividir en tres categorías según su composición: ácidos fenilcarboxílicos (incluido el o-hidroxifenol, catecol, ácido gálico, ácido shikímico, etc.), derivados de fenilpropanoides (incluido el ácido clorogénico , ácido cinámico, ácido cumárico, ácido cafeico, taninos, lignina, etc.), la tercera categoría son los derivados de flavon (incluidas antocianinas, flavonoides, rutina, etc.), pero no todas las sustancias fenólicas son todos sustratos de PPO.

En los tejidos vegetales en desarrollo normal, el sustrato, el oxígeno y la PPO existen al mismo tiempo y no se produce el oscurecimiento. Esto se debe a que los polifenoles se distribuyen en las vacuolas de las células del tejido normal. varios plastidios o citoplasma. Esta distribución regional evita que el sustrato entre en contacto con la PPO.

Cuando la estructura de la membrana celular cambia y se destruye, se crean las condiciones para que la enzima entre en contacto con la PPO, que oxida las sustancias fenólicas en quinonas en presencia de oxígeno, sufre una serie de reacciones de deshidratación y polimerización, y finalmente forma una sustancia de color marrón oscuro, que provoca el oscurecimiento.

3 Contramedidas para prevenir el pardeamiento de los explantes

Teóricamente, el pardeamiento enzimático se puede inhibir mediante los siguientes tres métodos: primero, eliminar las sustancias que causan oxidación—-el segundo es capturar; o reducir los productos intermedios de la reacción de polimerización; el tercero es inhibir las enzimas relacionadas. En la práctica, las siguientes medidas se consideran efectivas.

3.1 Selección de explantes adecuados

A la hora de recolectar materiales se debe prestar atención a seleccionar variedades y partes con menor grado de pardeamiento como explantes. El grado de pardeamiento de las plantas adultas es más grave que el de las plántulas, y el pardeamiento de los materiales de verano es más grave que el de los materiales de invierno, principios de primavera y otoño. Los cogollos de invierno no son fáciles de cultivar, por lo que se deben utilizar como explantos materiales de principios de primavera y otoño. Wang Yixing[5] utilizó pruebas de inducción de diferentes tejidos de plántulas estériles de lichi para demostrar que los tallos eran los más fáciles de inducir callos, y los callos de color amarillo claro crecieron después de 2 semanas de cultivo, la mayoría de las hojas no pudieron producir callos ni callos inducidos. El callo mostró un pardeamiento moderado; mientras que la mayoría de las raíces no produjeron callo y el callo inducido estaba todo pardeado.

3.2 Tratamiento de explantes

Los efectos tóxicos de las sustancias quinonas se pueden reducir mediante el tratamiento previo de materiales de explantes que son propensos a oscurecerse. El método de tratamiento es el siguiente: después de lavar los explantes con agua corriente, se tratan a una temperatura baja de 2 a 5 °C durante 12 a 24 horas, luego se desinfectan con cloruro de mercurio o alcohol 70 y luego se inoculan en agar. medio que contiene sólo sacarosa y se cultiva durante 5-7 días, permitiendo que las sustancias fenólicas del tejido penetren parcialmente en el medio de cultivo. Sacar el explante y remojarlo en solución de lejía 0,1 durante 10 minutos, y luego inocularlo en un medio de cultivo adecuado. Si aún se escapan sustancias fenólicas, transfiera el medio de cultivo 2-3 veces después de 3-5 días. Cuando la incisión del explante sane, las sustancias fenólicas disminuirán, lo que puede reducir o inhibir completamente el oscurecimiento del explante. He Qiongying et al. [6] utilizaron ácido ascórbico para pretratar los explantes chupadores de yemas de plátano, lo que puede reducir el oscurecimiento de los explantes y, por lo tanto, aumentar la tasa de inducción de los racimos de yemas.

3.3 Medio adecuado

La composición del medio está relacionada con el grado de dorado, y se debe considerar el estado y tipo del medio seleccionado.

3.3.1 Concentración adecuada de sales inorgánicas Zhang Miaoxia et al. [7] realizaron una prueba para prevenir el oscurecimiento del cultivo de tejido de árbol de caqui. Las sales inorgánicas de los cuatro medios de cultivo se modificaron para mejorar la MS (los macroelementos fueron). reducido a la mitad) y 1/2MS tienen el mejor efecto, mientras que MS tiene un efecto pobre. Los resultados demuestran que bajas concentraciones de sales inorgánicas pueden promover el crecimiento y la diferenciación de los explantes y reducir el grado de oscurecimiento de los explantes. Xu Zhenbiao [1] examinó callos resistentes al NaCl de embriones de maíz jóvenes y demostró que a medida que aumentaba la concentración de NaCl, el fenómeno de oscurecimiento empeoraba.

3.3.2 Cantidad adecuada y adecuada de hormona Wang Yixing [5] Durante el proceso de cultivo de tejidos de lichi, cuando se añadió 1 mg/LBA 0,5 mg/L2,4-D al medio de cultivo, el callo El tejido era más duro. Prolifera lentamente y es propenso a oscurecerse. Cuando se agrega 1 mg/LBA 1 mg/L2,4-D al medio de cultivo, el tejido del callo será de color amarillo claro y suelto, y proliferará rápidamente.

3.3.3 La dureza del medio de cultivo está dentro de un cierto rango. Si la cantidad de agar es grande, la dureza del medio de cultivo será alta y la tasa de pardeamiento será baja [8]. Esto puede deberse a que la dureza del medio de cultivo afecta la difusión de sustancias fenólicas en aras de la velocidad.

3.3.4 Influencia de la dureza del agua en el medio de cultivo El agua destilada con baja dureza tiene un bajo índice de pardeamiento, pero si se utiliza agua del grifo con mayor dureza el pardeamiento será severo e incluso pardeado. la muerte ocurrirá [8]. Esto puede deberse a que el agua utilizada para preparar el medio de cultivo cambia la concentración de sales inorgánicas en el medio de cultivo, lo que afecta indirectamente el oscurecimiento de los explantes de plantas.

3.3.5 Valor de pH del medio de cultivo En el cultivo de células somáticas de arroz, cuando el valor de pH es 4,5-5,0, el medio de cultivo líquido MS puede mantener el callo en un buen estado de crecimiento y su superficie será amarilla. -blanco Cuando el valor del pH es 5,5-6,0, el callo se vuelve muy dorado [9]. En términos generales, un ambiente ácido (valor de pH de 4,5 a 5,0) no favorece la aparición del proceso de oscurecimiento [10].

3.3.6 Si las condiciones de cultivo son demasiado altas o la luz es demasiado fuerte, la luz aumentará la actividad de la PPO y promoverá la oxidación de los polifenoles, acelerando así el oscurecimiento del tejido cultivado.

Las altas concentraciones de CO2 también promoverán el oscurecimiento. La razón es que el CO2 en el ambiente se difunde hacia las células, aumentando el CO32- intracelular se combina con el CO32- en la membrana celular, lo que reduce el CO32- efectivo, lo que lleva al colapso del sistema de endomembrana. y fenol El contacto entre sustancias similares y PPO provoca el oscurecimiento [11]. Por tanto, el cultivo inicial debe realizarse en la oscuridad o con poca luz.

3.4 Añadir inhibidores de pardeamiento y adsorbentes

Los inhibidores de pardeamiento incluyen principalmente antioxidantes e inhibidores de PPO. La adición de antioxidantes como metabisulfito de sodio, L-cisteína, ácido ascórbico, ácido cítrico y ditiotreitol al medio de cultivo puede reaccionar con el producto de oxidación quinona y reducirlo a fenol [12]. Dado que sus procesos de acción son consuntivos, se debe prestar atención a la cantidad agregada en aplicaciones prácticas. La L-cisteína y el ácido ascórbico no tienen efectos tóxicos ni secundarios sobre los explantes y pueden usarse sin restricciones en aplicaciones de producción. En el medio de cultivo de células de arroz, la adición de ácido fítico (PA) puede prevenir el oscurecimiento. Los numerosos grupos hidroxilo en las moléculas de PA producen efectos antioxidantes, reduciendo el contenido de sustancias cromogénicas o PA que se combinan con Cu2 en las moléculas de PPO, reduciendo así su vitalidad. . Chen Xuesen et al. [13] también confirmaron que el ácido fítico puede inhibir la actividad de la polifenol oxidasa en su estudio sobre la aplicación de ácido fítico en el cultivo de tejidos de ginkgo.

Los adsorbentes más utilizados incluyen el carbón activado y la polivinilpirrolidona (PVP). El carbón activado es un adsorbente inorgánico altamente absorbente que puede adsorber sustancias nocivas en el medio de cultivo, incluidas impurezas en agar, fenoles y quinonas secretadas por el cultivo durante el proceso de cultivo y el 5% de la sacarosa producida durante la desinfección a alta presión. , etc., facilitando así el crecimiento de las culturas. El carbón activado en polvo tiene una adsorción más fuerte que el carbón activado granular. Generalmente, se agregan 1-4 g/L de carbón activado al medio de cultivo. Durante el uso, se debe prestar atención al uso de la concentración más baja de carbón activado para combatir el pardeamiento, porque el efecto de adsorción del carbón activado no es selectivo. Al absorber sustancias, también absorberá otros componentes en el medio de cultivo, lo que afectará a los explantes. La inducción de la diferenciación tendrá ciertos efectos negativos [14]. La polivinilpirrolidona (PVP) es un adsorbente específico para sustancias fenólicas. A menudo se usa como agente protector para sustancias fenólicas y orgánulos celulares en preparaciones bioquímicas y puede usarse para prevenir el oscurecimiento [15].

3.5 Realizar cribado celular y transferencias múltiples

Durante el proceso de cultivo de tejidos, se suele realizar un cribado celular para eliminar las células propensas a oscurecerse. Los explantes deben transferirse inmediatamente a un medio de cultivo fresco 1-2 días después de la inoculación. Esto puede reducir el efecto tóxico de las sustancias fenólicas en el cultivo y reducir el efecto inhibidor, de modo que los explantes puedan diferenciarse lo más rápido posible después de la transferencia continua. -6 veces, básicamente puede resolver el problema del oscurecimiento de los explantes.

Referencias:

[1]Xu Zhenbiao et al. Fenómeno de pardeamiento durante el cultivo de tejidos vegetales. Foreign Agriculture Sciences - Cereal Crops, 1997(1):55～56.

[2] Fu Jin. Investigación sobre la germinación en latencia de tres tipos diferentes de semillas y el proceso de envejecimiento de las semillas de Acacia acacia. Tesis de maestría de la Universidad Agrícola de Beijing, 1996.

[3] Fu. Zuoshen, Detección y análisis característico del callo embrionario inmaduro de maíz resistente al NaCl, tesis de maestría de la Universidad de Agricultura y Ganadería de Changchun, 1996.

[4] Editado por Yan Changmin, Plant Tissue Culture Handbook, Shanghai Science and Technology Press, 1990.

[5] Wang Yixing. Estudio preliminar sobre cultivo de células de litchi.

[6] He Qiongying et al. Pretratamiento con ácido ascórbico Informe preliminar sobre la investigación sobre la prevención del oscurecimiento de los explantes de yemas de plátano Revista de la Universidad Agrícola del Sur de China, 1995, 16(3): 79～82.

[7 ] Zhang Miaoxia. Prevención de explantes en cultivos de tejidos de árboles de caqui. Investigación sobre el pardeamiento. Revista de la Universidad Agrícola de Henan, 1999, 33(1): 87～91.

[8] Jin Jianmin. relacionado con la inducción embrioide en panículas de arroz y semillas maduras. Plants Bulletin of Botany, 1992, 9(2): 53～54.

[9] Jin Jianmin Discusión sobre los factores relacionados con la inducción embrioide en arroz joven. borradores y semillas maduras. Bulletin of Botany, 1992.

[10] Wang Dongxia et al., Cómo combatir el oscurecimiento de los tejidos en los tejidos vegetales, Chinese Flower Bonsai, 2002, 12:29～30.

[11] Yao Hongjun, Luo Xiaofang, Tian Yanting. Progreso de la investigación sobre el pardeamiento de explantes de cultivo de tejidos. Revista de la Universidad Forestal de Beijing, 1999, 21(3): 78～83.

[12] Cai Jinxing et al. Características de la polifenol oxidasa en diferentes variedades de peras e investigación sobre sus inhibidores.

[ 13] Chen Xuesen, Zhang Yanmin et al., Investigación sobre la aplicación de ácido fítico en el cultivo de tejidos de Ginkgo, Investigación y desarrollo de productos naturales, 1997, 9(2): 24～27.

[14] Liu Yongsheng. El uso de carbón activado en el cultivo de tejidos vegetales. Plant Physiology Communications, 1994, 30(3): 214.

[15] Yao Hongjun et al.

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------------------------------------------- del cultivo de tejidos vegetales

El cultivo de tejidos vegetales es una tecnología de cultivo de plantas estériles que se basa en la teoría de que las células vegetales son totipotentes y utiliza órganos, tejidos o células aisladas de las plantas, como raíces, tallos y hojas. , flores, frutos, semillas, embriones y óvulos, ovario, anteras, polen y parénquima y tejido vascular de órganos de almacenamiento, etc., en medios de cultivo artificiales estériles y adecuados, luz, temperatura y otras condiciones, callos, adventicios. Se pueden inducir yemas y raíces adventicias, y finalmente formar una planta completa. Hasta la fecha, la tecnología de cultivo de tejidos se ha utilizado ampliamente en países de todo el mundo para la propagación clonal, el mejoramiento floral, la eliminación de virus de plantas y la preservación de germoplasma.

(1) Aplicación de técnicas de cultivo de tejidos

1. Propagación clonal La propagación clonal es una de las principales aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales. Las ventajas de utilizar el cultivo de tejidos vegetales para la propagación asexual son que utiliza menos material, es rápida y no se ve afectada por condiciones naturales como el clima, la estación, el sustrato. etc., y es mejor que los métodos convencionales tradicionales. El método de propagación es mucho más rápido y también se denomina "propagación rápida" o "micropropagación". Sus métodos de propagación comunes incluyen esquejes de ramas cortas, proliferación de yemas, protocormos, diferenciación de órganos y generación de cuerpos embrioides. Entre ellas, la proliferación de yemas es la más utilizada en la propagación de flores en macetas, como begonias herbáceas, crestas de gallo, caléndulas y bígaros de follaje: begonia, reticulata, caladio, arrurruz de terciopelo y plantas leñosas, flores triangulares, rododendros belgas, rosas, hortensias, etc. han logrado buenos beneficios económicos en la práctica de producción.

El cultivo de protocormos se utiliza ampliamente en la producción a gran escala de plantas de orquídeas como cymbidium, phalaenopsis, paphiopedilum, dendrobium, orquídeas de primavera y helechos ornamentales como helechos renales, helechos y helechos cuerno de ciervo. En el cultivo de cuerpos embrioides, se informa que se ha observado que los callos de 150 especies de plantas en 30 familias pueden diferenciarse en cuerpos embrioides, y las flores en macetas como el taro y la camelia son ejemplos exitosos. La diferenciación de órganos produce principalmente yemas o raíces adventicias directamente a partir de explantes. Las plantas generalmente no se forman a través de la diferenciación de órganos a partir de callos, porque sus rasgos pueden cambiar o la capacidad de regenerar plantas se perderá después de múltiples subcultivos.

2. Mejoramiento de flores La tecnología de cultivo de tejidos también se usa ampliamente en el mejoramiento de flores en macetas en la actualidad.

Cultivo de embriones: En la hibridación interespecífica o hibridación a distancia de flores, en ocasiones aunque la fecundación puede ser normal, muchas veces el embrión no se desarrolla completamente o existe incompatibilidad entre el embrión y el endospermo, por lo que no se pueden obtener semillas. se puede utilizar el cultivo temprano in vitro promueve el desarrollo normal de los embriones y produce descendencia híbrida. Por ejemplo, en la hibridación de camelias, lirios e iris, se cultivaron embriones jóvenes y se obtuvieron con éxito semillas híbridas. Al mismo tiempo, si la fertilización resulta difícil durante la hibridación, los óvulos no fertilizados también se pueden separar y fertilizar con polen en un tubo de ensayo. Esto ha tenido éxito en el abrojo de flores herbáceas.

Cría haploide: utilice cultivo de anteras para inducir que el polen forme haploides y trátelo con colchicina en cultivo en probeta para duplicar los cromosomas y convertirse en plantas diploides homocigotas, acortando así el tiempo de reproducción de nuevas variedades. También favorece el aislamiento de mutaciones recesivas entre mutaciones. Esto produce variaciones en el tipo de planta, color de flor, tamaño de flor o pétalos dobles, tipo de hoja, color de hoja, etc., lo que a menudo tiene un valor de utilización directo. Esto se ha utilizado en la cría de petunias.

Hibridación somática e ingeniería genética vegetal: Utilizando la tecnología de manipulación genética de protoplastos, se pueden obtener híbridos somáticos o híbridos nucleoplásmicos a partir de plantas de diferentes géneros que es poco probable que se hibriden. Ciertos rasgos importantes de las plantas pueden modificarse de manera específica ingiriendo genes exógenos de interés.

3. Eliminación de virus en plantas Las especies de flores que utilizan métodos de propagación asexual, como crisantemos, claveles, tulipanes, lirios, lirios de la paz, etc., no pueden eliminar los virus a través de las semillas, y los métodos de control químico y los tratamientos a alta temperatura a menudo tienen resultados inestables. Como material de propagación asexual para el cultivo de tejidos, es mejor eliminar el tejido viral; de lo contrario, fácilmente se acumulará el virus y se agravará el daño. Las puntas de los tallos de las plantas no tienen haces vasculares, lo que dificulta la invasión de virus. Por lo tanto, el cultivo de puntas de brotes es la mejor manera de obtener plantas libres de virus. Hasta ahora, el método de desintoxicación del cultivo de la punta del tallo se ha popularizado y utilizado en flores en macetas como crisantemos, lirios, claveles y tulipanes.

4. Las plantas propagadas asexualmente para la conservación del germoplasma no tienen semillas y sólo pueden cultivarse y conservarse en jardines botánicos durante mucho tiempo, lo que consume mucha tierra y mano de obra. Los materiales de germoplasma también son susceptibles a cambios en el entorno natural y a daños causados ​​por plagas y enfermedades. Si se utilizan métodos de cultivo de tejidos para preservar callos, cuerpos embrioides, puntas de brotes y otros tejidos, se puede ahorrar mucha mano de obra y recursos materiales.

(2) Varios pasos del cultivo de tejidos

1. Selección de materiales Los materiales que generalmente se utilizan para el cultivo de tejidos se denominan explantes. A menudo se divide en dos categorías. Un tipo son los explantes con yemas, como puntas de tallo, yemas laterales, yemas de bulbo, protocormos, etc., que pueden inducir directamente la producción de yemas agrupadas durante el proceso de cultivo de tejidos. La tasa de éxito en la obtención de plantas regeneradas es alta, la variabilidad es pequeña y las excelentes propiedades del material se pueden mantener fácilmente. La otra categoría incluye principalmente órganos vegetativos como raíces, tallos y hojas, y órganos reproductivos como anteras, pétalos, raquis, cáliz, óvulos y frutos. Este tipo de explante requiere un proceso de desdiferenciación, pasa por la etapa de callo, luego se diferencia en yemas o produce cuerpos embrioides, para luego formar plantas regeneradas.

La selección y ubicación del tejido del explante, la edad de la planta, la época de cosecha y el estado fisiológico y la calidad de la planta tienen un cierto impacto en la diferenciación de los órganos durante el cultivo. En general, las plántulas jóvenes son más fáciles de diferenciar que los cultivares más viejos, las yemas terminales son más fáciles de diferenciar que las yemas axilares y las yemas en germinación son más fáciles de diferenciar que las yemas latentes. En el cultivo de tejidos, el explante más utilizado es la punta del tallo, que suele cortarse en trozos de aproximadamente 0,5 cm. Si es demasiado pequeño, tiene poca capacidad para producir callos y, si es demasiado grande, lo absorberá. demasiado espacio en la botella de cultivo. Para cultivar plántulas libres de virus se utiliza habitualmente el meristemo de la punta del brote, con una longitud inferior a 0,1 mm.

2. Desinfección de explantes Uno de los factores importantes en el éxito del cultivo de tejidos vegetales es garantizar que el cultivo pueda crecer de forma segura en condiciones estériles. Por este motivo, es necesario realizar un buen trabajo en la desinfección de explantes e implementar operaciones asépticas.

Dado que la mayoría de los materiales vegetales cultivados se recolectan de plantas cultivadas en el campo, a menudo se adhieren varios microorganismos a los materiales, una vez introducidos en el medio de cultivo, se multiplicarán y crecerán rápidamente, provocando contaminación y fracaso del cultivo. Por lo tanto, los explantes deben esterilizarse estrictamente antes del cultivo. El nivel de desinfección debe matar todos los microorganismos adheridos a los explantes sin dañar la vitalidad de los materiales. Por tanto, es necesario seleccionar correctamente el desinfectante y la concentración utilizada, el tiempo de tratamiento y los procedimientos. Actualmente, los desinfectantes de uso común incluyen hipoclorito de calcio, cloruro de mercurio, hipoclorito de sodio, peróxido de hidrógeno, alcohol (70%), etc. Los métodos de desinfección específicos son los siguientes:

(1) Desinfección de puntas de tallos, tallos y hojas Antes de la desinfección, enjuáguelos con agua limpia o utilice un cepillo suave para eliminar el polvo. lávelos con jabón y luego lave el jabón con agua limpia. Después del lavado, use papel absorbente para secar la humedad de la superficie. Remoje en alcohol al 70% durante unos segundos. Después de sacarlo, sumérjalo en hipoclorito de calcio al 10%. sobrenadante saturado durante 10 a 20 minutos. O sumérjalo en una solución de hipoclorito de sodio del 2 % al 10 % durante 6 a 15 minutos. Después de la desinfección, enjuague con agua esterilizada tres veces y seque la inoculación con una gasa esterilizada o papel esterilizado.

(2) Desinfección de raíces, tubérculos y bulbos La mayoría de estos materiales crecen en el suelo, a menudo con tierra, y se dañan fácilmente al excavar. Antes de la desinfección, se debe limpiar con agua limpia, use un cepillo o cepillo suave para eliminar la suciedad de las áreas irregulares y los espacios entre las escamas. Después de secar con papel absorbente, remoje en alcohol al 70% y luego use remojo al 10%. solución de hipoclorito de sodio durante 5 a 15 minutos, o desinfectar con 0,1% a 0,2% de cloruro de mercurio durante 5 a 10 minutos, y finalmente lavar con agua esterilizada 3 a 4 veces, usando gasa o papel esterilizado. Secar e inocular.

(3) Desinfección de frutos y semillas Algunos de estos materiales tienen pelos o cera en su piel. Antes de la desinfección, remojarlos en alcohol al 70% durante unos segundos o de 2 a 10 minutos, y luego aplicar. con polvo blanqueador saturado. Desinfectar con líquido transparente durante 10 a 30 minutos o remojar en solución de hipoclorito de sodio al 2% durante 10 a 20 minutos. Después de la desinfección, retire la cáscara y saque el tejido interno o las semillas para la inoculación. Esterilizar directamente con semillas o frutos. Los materiales esterilizados deben enjuagarse con agua esterilizada varias veces antes de la inoculación.

(4) Desinfección de anteras y polen Las anteras de las plantas suelen estar envueltas por pétalos y cáliz. Generalmente se encuentran en estado estéril y sólo pueden inocularse mediante desinfección de la superficie. Por lo general, primero use una bola de algodón con alcohol al 70% para limpiar los botones florales o las vainas de las hojas, luego retire los botones florales, sumérjalos en el sobrenadante del polvo blanqueador saturado durante 10 a 15 minutos, enjuáguelos con agua esterilizada de 2 a 3 veces. y séquelos antes de la inoculación.

3. Condiciones de cultivo de tejidos: El recipiente de cultivo después de la inoculación se coloca en la sala de cultivo. La temperatura ambiente debe controlarse entre 23 y 26 °C, con 12 a 16 horas de luz por día y una iluminación de 1000 a 3000 lux.

4. Proliferación de explantes Para diferenciar los explantes después de la inoculación en yemas plexiformes, tejido calloso o cuerpos embrioides, se deben diseñar y seleccionar estrictamente los tipos y concentraciones de medios de cultivo y hormonas. El medio básico comúnmente utilizado es el medio MS. El tipo y la concentración de hormonas juegan un papel importante en la diferenciación y proliferación de los explantes. En otras palabras, diferentes tipos de flores tienen diferentes tipos y concentraciones de hormonas (Tabla 4-3).

5. Las yemas adventicias y las yemas laterales formadas por subcultivo de enraizamiento inducido generalmente no tienen raíces para promover el enraizamiento de las plántulas de tubo de ensayo, deben transferirse a un medio de enraizamiento. El medio de enraizamiento generalmente usa medio 1/2MS, porque reduce la concentración de sales inorgánicas. es beneficioso para el desarrollo de las raíces. Al mismo tiempo, los tipos y concentraciones de auxinas requeridas por diferentes flores en macetas para inducir el enraizamiento son diferentes (Tabla 4-4). Generalmente, se utilizan tres tipos: ácido indol acético (IAA), ácido naftaleno acético (NAA) y ácido indol butírico (IBA). Generalmente, se puede obtener un sistema de raíces fuerte después de cultivar en un medio de enraizamiento durante aproximadamente 1 mes.

6. Cuando las plántulas de cultivo de tejidos trasplantadas echan raíces o las plántulas de tubo de ensayo que forman primordios de raíces pasan de un ambiente estéril y estable de temperatura, luz y humedad a un ambiente natural, y pasan de heterótrofos a autótrofos, deben pasar por un proceso de endurecimiento de las plántulas. Primero, abra el corcho del tubo de ensayo y colóquelo en un lugar soleado para dejarlo actuar durante 1 o 2 días. Luego saque las plántulas, enjuague el agar con agua tibia y trasplántelas a una matriz compuesta de turba. perlita, vermiculita, ceniza de paja, etc. Antes de usar la matriz, se debe proporcionar una sombra adecuada después del trasplante. Se puede cubrir con una película plástica para mantener una alta humedad del aire. C. No lo exponga a la luz solar directa. Preste atención a la ventilación y al riego suplementario después de 7 a 10 días, aproximadamente 20 días después de que comiencen a crecer nuevos brotes, las plántulas se pueden transferir al manejo normal.