Métodos analíticos para el extracto de cardo mariano
1. Determinar el contenido de silimarina mediante espectrofotometría.
Pesar con precisión una cantidad adecuada del polvo de este producto, colocarlo en un matraz aforado de 50ml, añadir 40ml de etanol absoluto para disolver. , diluir a volumen y agitar bien. Pipetear con precisión 5 ml en un matraz volumétrico de 100 ml, agregar etanol absoluto hasta la marca, agitar bien y hacer un control en blanco al mismo tiempo. Un espectrofotómetro UV midió la absorbancia a 288 nm. Calcule el contenido de acuerdo con la siguiente fórmula:
Contenido de silimarina = (calculado como silibina) × 100
A: Valor de absorbancia de la muestra M: Volumen de muestra (g); Factor de dilución; 470: Coeficiente de absorción de silibinina.
Nota: Este método se deriva de los estándares locales de la provincia de Liaoning y es adecuado para la determinación del contenido de extracto de cardo mariano con un valor de HPLC de no menos de 60.
2. Determinar el contenido de silimarina mediante espectrofotometría.
Pesar con precisión unos 250 mg del extracto refinado y colocarlo en un matraz aforado de 50 ml. Añadir una cantidad adecuada de metanol para disolverlo y. ajuste el volumen a 50 ml. Agite bien y la solución será el líquido de prueba.
Poner 1 ml de la solución problema en un matraz aforado de 10 ml, añadir 2 ml de reactivo de 2,4-dinitrofenilhidrazina, agitar bien, tapar, calentar a 50°C durante 50 minutos, enfriar, y agregue hidrógeno. Lleve la solución metanólica de óxido de potasio hasta la marca, agite bien y déjela reposar durante 2 minutos. Tome 1 ml de esta solución en un tubo de centrífuga, agregue 20 ml de metanol, agite bien y centrifugue. Verter el sobrenadante de color marrón rojizo en un matraz aforado de 50 ml, añadir 20 ml de metanol al residuo y centrifugar, combinar los sobrenadantes y diluir hasta la marca con metanol.
Pipetear con precisión 1 ml de metanol en un matraz aforado de 10 ml, y operar de la misma forma que desde “Añadir 2 ml de reactivo 2,4-dinitrofenilhidrazina” como control en blanco.
Utilizar la solución en blanco como control, medir el valor de absorbancia A de la concentración medida a 490 nm y calcular el contenido de silimarina con E=537.
3. Determinación del contenido de silimarina mediante espectrofotometría (Farmacopea Alemana DAB-9 edición 1997)
Preparación de la solución estándar: Pesar con precisión 25 mg de estándar de silibina y colocarlos en 5 ml Volumétricos. matraz, agregar metanol para disolver y ajustar el volumen a la marca para obtener una solución estándar con una concentración de 5 mg/ml.
Preparación de la solución muestra: Pesar 250 mg de silimarina en un matraz aforado de 50 ml, disolverlo con metanol, diluir hasta la marca y reservar.
Preparación de la solución de color: Solución de prueba de 2,4-dinitrofenilhidrazina: pesar 500 mg de este reactivo en un matraz aforado de 50 ml, añadir 1 ml de H2SO4 y diluir con metanol hasta obtener la báscula.
Solución 10KOH: Pesar 10gKOH y colocar en un matraz aforado de 100ml. Añadir 30 ml de agua y diluir a volumen con metanol.
Método de medición: Tome 1 ml de cada una de la solución estándar, la solución de muestra y el metanol y colóquelos en matraces volumétricos de 10 ml, y agregue 2 ml de la solución de prueba de 2,4-dinitrofenilhidrazina respectivamente. Los matraces se colocan en un baño de agua. Reacciona entre 50 y 55 °C durante 50 minutos. Después de enfriar rápidamente con agua del grifo, añade la solución de KOH hasta la marca. Toma 1 ml de las tres soluciones de reacción anteriores en un tubo de ensayo de 10 ml. tapar. Agregar 10 ml de metanol y mezclar bien. Centrifugar durante 10 min. Verter el líquido transparente en matraces volumétricos de 50 ml respectivamente, centrifugar el precipitado y agregar 10 ml de metanol, mezclar bien, centrifugar, verter el sobrenadante en el mismo matraz volumétrico de 50 ml respectivamente. , y repita una vez, agregue metanol hasta la marca en los tres matraces volumétricos de 50 ml. Agite bien y mida el valor de absorbancia a 490 nm con un espectrofotómetro UV.
El cálculo de la fórmula anterior se basa en la operación de muestreo y pesaje en estricta conformidad con los requisitos anteriores.
Si el pesaje no puede cumplir con precisión los requisitos del texto, calcule de acuerdo con la siguiente fórmula:
A1: Valor de absorbancia de la muestra; A2: Valor de absorbancia del estándar W1: Volumen de muestra de la muestra (g); volumen de muestra (g); V1: volumen de dilución de la muestra; V2: volumen de dilución estándar
4 Determinación del contenido de silimarina por espectrofotometría (Farmacopea de EE. UU.)
Solución de prueba: agregue aproximadamente 1,0 g. 2,4-dinitrofenilhidrazina (2,4-dinitrofenilhidrazina), se secó al vacío durante 8 horas, se pesó con precisión, se disolvió en 2 ml de ácido sulfúrico y se preparó temporalmente la solución.
Preparación de la solución estándar: disuelva el estándar de silibinina USP pesado con precisión en metanol para obtener una solución con una concentración de aproximadamente 2,0 mg/ml.
Preparación de la solución de muestra: Pesar con precisión unos 5,0 g de polvo fino de cardo mariano, colocarlo en un tubo de extracción y taparlo con una pequeña bolita de algodón. Conecte el manguito de extracción a un matraz de fondo redondo que contenga 150 ml de hexano y 250 ml de hexano conectado a un dispositivo de extracción continua. Caliente el manguito durante 4 horas. Luego, separe el matraz de fondo redondo que contiene hexano del dispositivo de extracción. el disolvente y secarlo. Retire el disolvente residual. Luego conecte la funda de extracción a un matraz de fondo redondo de 250 ml que contenga 100 ml de acetato de etilo conectado a un dispositivo de extracción térmica continua. Calentar la funda a reflujo durante 8 horas. Bajo presión reducida, se evapora el disolvente hasta sequedad en un rotavapor a 40 °C. . Disolver el residuo con 25 ml de metanol, filtrar cuantitativamente en un matraz de 50 ml, diluir a volumen con metanol y agitar bien. (Nota: este método de preparación es adecuado para materiales medicinales)
Detección: agregue 1,0 ml de solución de preparación estándar y solución de preparación de muestra en dos matraces de color ámbar de 10 ml, etiquételos con precisión y agregue 2 ml de solución de prueba respectivamente. , mezcla. Tape la botella, manténgala a 50 ± 1°C y revuelva lentamente durante 50 minutos. Enfriar, diluir la solución a volumen con metanol y mezclar. Tome 2,0 ml de las soluciones anteriores respectivamente, transfiéralo a un matraz de 100 ml y agregue 3,0 ml de solución de metanol de hidroxilato de tetrahidroamonio (25) [Nota: Prepare temporalmente hidroxilato de tetrahidroamonio, una solución transparente e incolora]. Diluir a volumen con metanol y dejar reposar el matraz durante 30 minutos. Al mismo tiempo, mida la absorbancia de la solución de preparación estándar y la solución de preparación de muestra en la celda de absorción de 1 cm a 490 nm. La solución de metanol se usa como blanco y se usa la siguiente fórmula para calcular el contenido porcentual de silibina y silimarina. :
5000(C /W) (Au/As)
C: es la concentración de silibina en la solución estándar (mg/ml W: es el peso seco); la silimarina utilizada en la solución de preparación de muestras (mg Au y As son las absorbancias de la solución de preparación de muestras y la solución de preparación estándar, respectivamente).
5. Determinación del contenido de silimarina por HPLC (método INA)
Condiciones cromatográficas: Columna: YMC-Mark ODS C18 5u 4,6×150mm (o Phenomenex Luna C18 5u 4,6×150mm) Fase móvil: Líquido A: 5 ml de ácido fosfórico añadidos a 995 ml de solución de metanol-agua (20:80), Líquido B: 5 ml de ácido fosfórico añadidos a 995 ml de solución de metanol-agua (80:20), eluir según el procedimiento de la Tabla 7; -1; Caudal: 1,0 ml/min; Temperatura de la columna: 40 °C; Longitud de onda de detección: 288 nm;
Preparación de la solución estándar: Pesar con precisión 10,00 mg de silibinina secada al vacío, disolverla en metanol y ajustar el volumen a 25 ml, que es la solución de referencia. Diluir según la proporción de 1:2, 1:10, 1:25, 1:50.
Preparación de la solución problema: Pesar con precisión unos 10g de polvo medicinal, utilizar 100ml de hexano en un extractor Soxhlet al baño María durante 4 horas hasta que el color sea claro (o incoloro) y extraer la solución. Desechar, evaporar el solvente para secar el residuo, agregar 90 ml de metanol al residuo y colocarlo en un baño de agua para extracción a reflujo durante 8 horas. Después de enfriar, cuantificar el extracto a 100 ml, diluirlo 25 veces, filtrar y. el filtrado es la solución de prueba.
Extracto: Pesar con precisión 70 mg del extracto en polvo (con una precisión de 0,1 mg), añadir 70 ml de metanol y realizar extracción ultrasónica durante 20 minutos, enfriar, ajustar el volumen a 100 ml y filtrar.
Método de medición: Inyecte la solución de referencia, el disolvente de extracción y la solución de prueba respectivamente, consulte la Figura 7-2. Dibuje una curva utilizando el área del pico del producto estándar frente a la concentración. El coeficiente de correlación lineal de silibinina A y B no debe ser inferior a 0,999 y la resolución no debe ser inferior a 1,8. Los tiempos de retención relativos de cada componente se muestran en la Tabla 7-2.
Tabla 7-2 Tiempo de retención relativo de cada componente
Componente YMC-Park Luna
Cálculo: Según el área total del pico de cada componente anterior Medición de silibina.
6. Determinación del contenido de Silibinina A y B en extracto de cardo mariano mediante HPLC.
Condiciones cromatográficas: precolumna: columna Bondapak C18/37-50 Micron de 2 cm: RP18 de 25 cm, 5 μm; Consulte la Tabla 7-3 para conocer los procedimientos de elución y fase móvil; caudal: 1,0 ml/min; longitud de onda de detección: 288 nm; volumen de inyección: 10 μl.
Tabla 7-3 Procedimiento de elución de la fase móvil
Tiempo (minutos) 5 solución de metanol de ácido acético 5 de ácido acético
Figura 7-2 HPLC de extracto de cardo mariano Figura
Solución prueba: Disolver 0,05g del extracto (30) en 100,0ml de metanol, y filtrar con membrana filtrante de 0,45μm para obtenerlo.
Solución de control: utilice metanol para preparar una solución que contenga aproximadamente 0,15 mg/l de silibinina.
Calculado mediante el método del estándar externo del área del pico de SilibininA B ().
7. Cromatografía de gases (muestreo de espacio de cabeza) para determinar las cantidades residuales de hexano y etanol en el extracto de cardo mariano.
Solución de estándar interno: pesar con precisión 250 mg de pentano para obtener xileno. matraz aforado de hasta 10 ml.
Solución de calibración: Pesar con precisión 100 mg de etanol, hexano y pentano, añadir xileno hasta completar un matraz aforado de 10 ml. Pipetee 10 l de la solución en la botella de muestreo del espacio de cabeza y séllela.
Solución de prueba: pese con precisión 0,1 ~ 0,5 g de extracto seco, coloque una botella de muestreo en el espacio de cabeza, agregue 10 μl de solución estándar interna (equivalente a 250 mg de pentano) y selle.
Parámetros de muestreo del espacio de cabeza: Temperatura: 110 ℃; Tiempo de ajuste de temperatura: 10 minutos; Tiempo de ajuste de presión: 1 minuto.
Condiciones cromatográficas: Columna: capilar de gel de sílice DB-1, 30m×0,25mm de diámetro interior, 0,1μm de espesor. Temperatura del horno: 40°C durante 7 minutos; luego 12°C/min, hasta 180°C; mantener durante 0,5 minutos hasta 280°C, luego mantener durante 10 minutos; Inyector: 150 ℃; Detector: FID250 ℃; Gas portador: Nitrógeno (5 psi); Relación de división: 1:5;
Utilice el valor integrado del pico cromatográfico del estándar interno para la cuantificación y calcule según la siguiente fórmula:
F=Ac×Ms/(Mc×As)
Ac: Área del pico cromatográfico del producto estándar de referencia; Ms: cantidad de estándar interno (μg/μl); As: área del pico cromatográfico del estándar interno; Mc: cantidad de estándar de referencia (μg/μl);
Contenido (mg/kg) =Ac×Ms×100/ (F×As×E)
Ac: área del pico cromatográfico del disolvente en la solución de prueba; : prueba La cantidad de estándar interno en la solución; Como: El área del pico cromatográfico del estándar interno en la solución de prueba E: El volumen de muestra;
Nota: Límite de detección: ambos son 1ppm: Tiempo de retención: unos 5,5 minutos para etanol y unos 10 minutos para hexano.
Límites: El etanol no debe exceder el 0,5 y el hexano no debe exceder las 10 ppm.
8. Determinación del residuo de acetona en extracto de cardo mariano mediante cromatografía de gases.
Solución de patrón interno: Pesar con precisión la acetona y añadir agua para ajustar el volumen a 6,00 mg/ml.
Solución de calibración: Pesar con precisión la acetona y añadir agua para ajustar el volumen a 0,30 mg/ml.
Solución prueba: Pesar con precisión 5g de extracto seco, añadir 120ml de agua, calentar, añadir 2 gotas de antiespumante y 5,00ml de solución de estándar interno. Evaporar a aproximadamente 80 ml.
Condiciones cromatográficas: Columna: OV101, 50 m, diámetro interior 0,32 mm, espesor 0,1 μm; Temperatura del horno: Sotherm a 30 ℃; Muestreador: 250 ℃; Detector: FID 250 ℃; caudal: 1 ml/min; relación de división: 1:70.
Cuantificar utilizando el valor de integración pico de la cromatografía estándar externa.
Nota: Límite de detección: acetona 0,1 ppm; Límite de cuantificación: acetona 1,0 ppm; Tiempo de retención: acetona aproximadamente 4,7 minutos.
Límite: La acetona no debe exceder las 20 ppm