¿Cuáles son los métodos para conservar las semillas madre?
Hay muchas formas de preservar las especies madre, y el método específico a utilizar debe determinarse según la situación real. Los métodos básicos comúnmente utilizados incluyen: criopreservación en subcultivo inclinado, preservación de la matriz natural (conservación de granos de trigo, preservación de paja de estiércol fermentado, preservación de aserrín, preservación de salvado de trigo + astillas de madera, preservación de bloques de madera + agar, preservación de cepas de hongos de paja en polvo de paja de arroz, preservación de ramas ), conservación de líquidos [conservación de aceite mineral, conservación de solución salina fisiológica de bola de micelio, conservación de agua destilada, conservación de solución nutritiva, conservación de nitrógeno líquido (Figura 2-12)], conservación de papel de filtro de esporas, conservación de liofilización al vacío, nitrógeno líquido ultra bajo preservación de la temperatura, preservación del tubo del suelo de arena de esporas, preservación del secado al vacío Soxhlet y otros métodos. Para garantizar el efecto de conservación, las instituciones especializadas en la conservación de cepas bacterianas deben utilizar al menos tres métodos para conservar cada variedad al mismo tiempo, a saber, el método a largo plazo, el método a medio-largo plazo y el método a corto plazo. método. Por limitaciones de espacio no se introducirán uno a uno. A continuación solo se presentan los métodos de conservación en matriz y a baja temperatura de uso común y varios métodos de conservación locales para los productores de hongos.
Figura 2-12 Método de conservación con nitrógeno líquido de especies madre
(1) Criopreservación por subcultivo inclinado
Este es un método tradicional y de uso común. Un método de conservación simple. , es sencillo y fácil de implementar, no requiere equipo especial y el estado de las cepas conservadas se puede observar en cualquier momento. Sus desventajas son las frecuentes transferencias de tubos, el crecimiento vegetativo excesivo, propenso a la degradación y muchas oportunidades de errores técnicos durante la operación que pueden ocurrir por envejecimiento y muerte de las cepas debido a la falta de transferencia a tiempo y la contracción del medio de cultivo;
Este método se basa en el principio de que la baja temperatura puede inhibir el crecimiento de las hifas. Las cepas a conservar se inoculan en el medio de cultivo inclinado y se cultivan a la temperatura adecuada cuando el micelio crece de forma robusta y casi. Cubre la inclinación, sáquelo. Conservar en un lugar seco a temperatura baja de 2 a 5°C o en frigorífico o congelador. Se requieren trasplantes, transferencias y subcultivos a intervalos regulares (generalmente de 4 a 5 meses), y los detalles específicos deben determinarse en función de las características de la cepa bacteriana. Algunas variedades de hongos comestibles de temperatura media-alta y alta no son adecuadas para este método. Por ejemplo, la temperatura adecuada para la conservación de la mayoría de las variedades de hongos es de alrededor de 10°C, el Ganoderma lucidum chino es de 6-10°C y la paja. el champiñón es de 10-12°C. Puedes verter de 3 a 4 ml de anticongelante (10% de glicerol) sobre la colonia de hongos paja.
El medio de cultivo utilizado para la conservación no debe utilizar medios de cultivo sintéticos demasiado pobres o demasiado ricos en nutrientes. Generalmente se utilizan medios de cultivo naturales, como el medio de agar dextrosa de patata (PDA) y el medio integral de patata (. CPDA). Para evitar la producción de ácido, se debe agregar menos o nada de azúcar, y se deben agregar tampones como dihidrógenofosfato de potasio, hidrogenofosfato dipotásico, carbonato de calcio, etc. para neutralizar los ácidos orgánicos acumulados durante el proceso de conservación de las bacterias. Al mismo tiempo, se deben añadir 10 mg de vitamina B1 por 1000 ml y aumentar la cantidad de agar a 25 g para evitar que el agua del medio de cultivo se evapore demasiado rápido. Por ejemplo, al conservar setas shiitake y cepas de hongos negros, es más beneficioso sustituir la glucosa de la fórmula por maltosa. El tapón de algodón es un poco más largo, alcanza unos 3 cm dentro del tubo y se convierte en un medio de cultivo de altura media, es decir, la pendiente es pequeña y corta, y el medio de 1,5 cm en el fondo del tubo es de columna.
Sellar y conservar con tapón de goma: Utilizar un tapón de goma blanco del tamaño correspondiente a la boca del tubo de ensayo, limpiarlo y secarlo, introducirlo en una bolsa de polietileno de baja presión y esterilizarlo a 0,137 MPa durante 1 hora. En condiciones estériles, reemplace el tapón de algodón original con un tapón de goma estéril para las cepas inclinadas cultivadas y guárdelo en el refrigerador a una temperatura de 4 a 6 °C. El tiempo de almacenamiento puede ser de hasta más de 6 meses. Este método puede aislar el aire y evitar la evaporación, logrando un efecto similar al de la parafina líquida. Y es muy conveniente colocarlo, enviarlo por correo y transportarlo.
Notas:
① Las cepas conservadas deben ser cepas vigorosamente desarrolladas, y el tiempo de cultivo no debe ser demasiado largo para evitar reducir la vitalidad de las cepas.
② Se deben colocar etiquetas al producir semillas. Cada vez que se trasplanta, se debe verificar cuidadosamente el número de cepa y el tiempo de marcado para garantizar la precisión. Si se encuentran errores, se deben corregir de inmediato. confirmados, deben ser descartados.
③ Verifique periódicamente el estado de conservación. Una vez que se encuentre contaminación o contracción del medio debido a la pérdida de agua, se debe trasplantar y retirar inmediatamente.
④ Utilice el frigorífico lo menos posible para evitar la contaminación provocada por la condensación. Al abrirlo, debe abrirlo, sacarlo y cerrarlo al mismo tiempo. Lo mejor es instalar un frigorífico de almacenamiento permanente. con refrigerador para las cepas de uso común por separado.
⑤ Las cepas en conserva no deben amontonarse en el frigorífico; la temperatura de almacenamiento debe controlarse entre 3 y 5 °C y no debe ser ni demasiado alta ni demasiado baja.
⑥El frigorífico debe descongelarse periódicamente para eliminar el agua acumulada. Al almacenar, preste atención a que la humedad ambiental no sea demasiado alta. Si la humedad es demasiado alta, el moho crecerá fácilmente en el tapón de algodón y entrará en el tubo a través de la fibra de algodón. Por lo tanto, es mejor utilizar un tapón de goma o un tapón de esponja de silicona.
Si se utiliza un tapón de algodón, se puede envolver con papel limpio (se acepta papel sulfato o papel kraft), lo que también puede reducir la contaminación y retrasar el secado y la contracción del medio de cultivo.
⑦ Cuando se utilizan las cepas almacenadas, se deben sacar del refrigerador con 12 a 24 horas de anticipación y se pueden transferir a tubos solo después de que se hayan cultivado a una temperatura adecuada y hayan recuperado su vitalidad.
(2) Preservación de la matriz natural
Este es un método para preservar cepas bacterianas utilizando el medio en el que crecen naturalmente los hongos comestibles. Los sustratos comúnmente utilizados incluyen granos de trigo, medios de cultivo de granos, estiércol fermentado, astillas de madera, salvado de trigo y salvado de arroz.
① Conservación de granos de trigo (grano) Este método utiliza granos de trigo, granos de cereal o granos de maíz (triturados) como medio de cultivo. El micelio que ingresa a los granos está limitado en la protección de la epidermis y en la. granos Con el suministro de humedad, el período de almacenamiento puede alcanzar de 1 a 2 años. Tomando los granos de trigo como ejemplo, la introducción es la siguiente:
Primero lave los granos de trigo, remójelos en agua tibia a aproximadamente 20 ℃ durante 5 horas, luego retire y seque la humedad de la superficie (o hiérvalos). en agua durante 5 minutos hasta que la piel no se rompa), colóquelo en 2/3 ~ 3/4 de la longitud del tubo de ensayo, tápelo con un tapón de algodón y esterilícelo a una presión de 1,18 × 105 Pa durante 30 minutos. El contenido de humedad de los granos de trigo tratados no debe exceder el 25% y la epidermis no debe romperse durante el proceso de esterilización para proteger el micelio que ingresa a los granos de trigo. Después de la esterilización, agite los granos de trigo mientras están calientes. Después de enfriar, inocule el líquido de esporas o la suspensión de micelio o el bloque de micelio y luego cultívelo a 25 °C. Cuando el tubo de ensayo esté casi lleno de micelio, detenga el cultivo y guárdelo. en un lugar seco y fresco.
② Para la conservación de astillas de madera, utilice astillas de árboles de hoja ancha, salvado de trigo, 1% de azúcar y 1% de yeso. Mezcle bien, agregue una cantidad adecuada de agua y póngalo en 2/3 del. longitud del tubo de ensayo, presiónelo ligeramente y limpie la boca del tubo. Conecte el tapón de algodón, envuélvalo en papel, esterilícelo bajo una presión de 1,18 × 105 Pa durante 40 minutos, inocúlelo después de enfriarlo y cultívelo a 25 °. C. Cuando el micelio esté lleno, selle el tapón de algodón con cera o reemplácelo con un tapón de goma y luego envuélvalo en bolsas de plástico. Se pueden almacenar en un refrigerador a 4°C durante 1 a 2 años.
(3) Preservación a baja temperatura en el fondo del pozo
Este método utiliza el principio de temperatura constante y baja temperatura en el fondo del pozo para preservar las bacterias. Es adecuado para los hongos. agricultores que no tienen refrigeradores de conservación. Selle la especie madre del tubo de ensayo que se va a conservar con parafina con un tapón de goma esterilizado, colóquelo en un frasco sellado o en una bolsa de plástico, átelo bien y húndalo en el fondo del pozo para almacenarlo. 5 meses.
(4) Sellado y conservación con parafina
Corta el papel encerado en cuadrados de 6 a 8 cm y remójalo en alcohol al 75% durante 1 minuto. Gire la boca del tubo de ensayo cultivado sobre la llama de una lámpara de alcohol para esterilizarlo, luego use unas pinzas para quitar el papel encerado y ate firmemente la boca del tubo. Luego sumerja la boca del tubo envuelto en papel encerado en la parafina derretida hasta que el papel encerado esté completamente sumergido, de modo que el papel encerado quede bien envuelto en la pared del tubo para evitar fugas de aire. Una vez que la parafina se haya enfriado y solidificado, guárdela en el refrigerador o a temperatura ambiente.
(5) Sello de celofán para conservación
Utilizar 15 gramos de gelatina (aglutinante), 2 gramos de sulfato de cobre, 1 a 2 gotas de azul de metileno (indicador), disolver en 100 ml En agua caliente, preparar un sellador. Retire el tapón de algodón de la semilla femenina recién cultivada, con la boca del tubo hacia abajo, sumérjalo en agente sellador, péguelo con celofán (celuloide) empapado en alcohol al 95% y luego séllelo con cera de parafina. Los cultivos se pueden almacenar a temperatura ambiente durante al menos 8 meses y están protegidos de la infestación de moho o ácaros. La inyección de aceite mineral estéril (parafina líquida) en el bisel puede prolongar considerablemente el tiempo de conservación.
(6) Conservación del estiércol
Este método es adecuado para la conservación de hongos que pudren la hierba como Agaricus bisporus. Secar y triturar abono como estiércol de vaca descompuesto, tomar 300 gramos de abono seco, tamizarlo por un tamiz de apertura de 5 mm, agregar 1000 ml de agua para ajustar la humedad, ponerlo en un tubo de ensayo, ocupar de 1/3 a 1/ 2 de la profundidad del tubo y ajústelo a 0,15. Esterilice a una presión de MPa durante 2 horas. Después de confirmar la esterilidad, inocular y, una vez que el micelio haya crecido, conservarlo en un frigorífico a 3°C y trasplantarlo cada 2 años. Durante la conservación a largo plazo, si el medio de cultivo pierde agua, las cepas conservadas deben inocularse en agar inclinado a tiempo para su activación y luego continuar almacenándose. Después de 4 años de conservación continua mediante este método, no hubo cambios significativos en sus características de producción.