Técnicas comunes de extracción y purificación de ADN - Folleto
Por ejemplo, experimentos como la PCR y la hibridación Southern pueden básicamente garantizar la integridad de los fragmentos requeridos, mientras que los experimentos de secuenciación de segunda generación requieren un mayor nivel de integridad del ADN para obtener información completa de la secuencia.
Elimina disolventes orgánicos e iones metálicos de alta concentración que inhiben las moléculas enzimáticas en experimentos posteriores
Minimiza la contaminación de macromoléculas biológicas como proteínas, polisacáridos y polifenoles
Eliminar otros ácidos nucleicos (como el ARN en experimentos posteriores)
Sangre, tejidos animales, células cultivadas, colas de rata, etc.
Características: Gran número de células y composición de muestra relativamente uniforme. Suero, plasma, hisopos nasofaríngeos, esputo, líquido de lavado bronquial/alveolar, ascitis, virus, heces, muestras FFPE, etc.
Características: pequeño número de células, composición compleja de la muestra
Plantas comunes: Arabidopsis, trigo, maíz, arroz, etc.
Características: Existen estructuras protectoras como paredes celulares, y en las células hay vacuolas, cloroplastos, etc.
Características: En la célula existen estructuras protectoras como paredes celulares, hay vacuolas, cloroplastos, etc. Los orgánulos celulares como las vacuolas y los cloroplastos del interior de la célula son relativamente complejos
Polisacáridos y polifenoles: pulpa de frutas, semillas de plantas, etc.
Características: Los polisacáridos y los ácidos nucleicos tienen las mismas propiedades físicas y químicas. Los polifenoles son fáciles de combinar con los ácidos nucleicos después de la oxidación, afectando la extracción del ADN.
Bacterias: Bacterias Gram positivas. (Staphylococcus aureus, etc.), bacterias Gram negativas (E. coli, etc.)
Características: existen estructuras celulares como paredes celulares, y las estructuras celulares incluyen paredes celulares, vesículas celulares, cloroplastos y otros. orgánulos.
Características: Existe una pared celular, y algunas bacterias tienen flagelos y cápsulas
Hongos: Levaduras, hifas de hongos, etc.
Características: Los polisacáridos son los componente principal de la pared celular Componentes, los componentes internos de las células son relativamente complejos
Las muestras frescas se ven relativamente menos afectadas por las nucleasas endógenas y la calidad del ADN obtenido es relativamente buena.
Cuando se inyecta demasiada muestra, la lisis posterior no será suficiente para afectar a la extracción de ADN, y se introducirán excesivas impurezas y nucleasas endógenas.
Las hojas senescentes que contienen metabolitos secundarios como polisacáridos y polifenoles pueden morir de hambre en la oscuridad a 4 °C durante 1 o 2 días; la criopreservación o la congelación evitan que la ADNasa endógena degrade el ADN de la muestra.
Almacenamiento a corto plazo a -20 ℃ (1-3 meses), almacenamiento a largo plazo a -70 ℃ El tiempo de fijación de formalina es preferiblemente de 8 a 24 horas y el tiempo de almacenamiento de la muestra no debe exceder 1 año; muestras FFPE La temperatura de almacenamiento es de 4 ℃ y se recomienda no exceder los 3 años.
El uso prolongado de formalina para la fijación, su ingrediente activo formaldehído, formará extensos puentes de entrecruzamiento de metileno entre macromoléculas biológicas, lo que hará que las moléculas de ADN sean más frágiles y, bajo la acción de la fuerza de corte, en tales condiciones, Las moléculas de ADN son propensas a romperse. Al mismo tiempo, el ADN y las proteínas se entrecruzan ampliamente para formar un complejo sólido, lo que también evita que las proteasas digieran el tejido y afecta la extracción de ADN.
Se pueden utilizar tubos anticoagulantes con diferentes anticoagulantes para la recolección y almacenamiento, evitando la congelación y descongelación repetidas, el almacenamiento a corto plazo a 4°C durante 3-4 días, -20°C durante 2 años, y - 70°C para almacenamiento a largo plazo: Sangre total, glóbulos blancos, coágulos de sangre, suero o plasma.
Molienda u homogeneización de nitrógeno líquido
Molienda de nitrógeno líquido (la más recomendada)
La simple molienda puede garantizar que la muestra se almacene a baja temperatura para evitar la degradación del ADN
El ADN existe en los glóbulos blancos que contienen núcleos. La presencia de una gran cantidad de glóbulos rojos traerá más impurezas y nucleasas, por lo que es necesario utilizar una solución de lisis de glóbulos rojos para eliminar los glóbulos rojos con anticipación. .
Digerir las células de pared con tripsina antes de su recolección
Las células en suspensión solo necesitan ser centrifugadas y desechar el sobrenadante
Tratamiento de ruptura de pared con lisozima
Por ejemplo, para Staphylococcus aureus, agregue una cierta cantidad de lisozima e incube a 37 °C durante 30 minutos para completar el proceso de ruptura de la pared
Método de ruptura de la pared enzimática o congelación-descongelación con nitrógeno líquido o lisis ultrasónica
Tratamiento de desparafinación (usando xileno o aceite mineral)
CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) es un detergente catiónico que puede disolver las membranas celulares y se combina con el ácido nucleico para formar un complejo, que es soluble en. ambiente rico en sal.
1.
1. Tris-Hcl (PH8.0) proporciona un entorno tampón para evitar que los ácidos nucleicos se dañen
2. EDTA puede quelar Mg2+ o iones Mn2+, que inhiben la actividad de la ADNasa
3. Nacl puede proporcionar un ambiente rico en sal para disolver completamente el ADN en la fase líquida
4. CTAB puede lisar células y combinarse con ácidos nucleicos para formar complejos Soluble en ambientes con alto contenido de sal
El método SDS (dodecilsulfato de sodio) es un detergente aniónico que puede lisar células a alta temperatura (55-60 ℃), desnaturalizar proteínas y separar cromosomas. El complejo formado al combinarse con proteínas, polisacáridos, etc. en un ambiente salino o a temperatura reducida precipita y libera ácidos nucleicos.
Bajo la acción del hidróxido de sodio (ambiente alcalino PH12-12,6) y el detergente SDS, las células se rompen, las proteínas bacterianas y el ADN cromosómico se desnaturalizan, los enlaces de hidrógeno de la doble cadena del ADN se rompen y el ADN se desnaturaliza. Después de agregar un tampón ácido con alto contenido de sal, el pH vuelve a ser neutro y la velocidad de recuperación del ADN plasmídico de círculo cerrado altamente valente es más rápida que la del ADN cromosómico lineal. Las proteínas bacterianas, las paredes celulares rotas y el ADN cromosómico desnaturalizado se entrelazan entre sí para formar grandes complejos que están recubiertos con SDS. Luego los complejos precipitan, dejando el ADN plasmídico en el sobrenadante.
Lisar las bacterias calentando a 100°C en un tampón que contiene Triton X-100 y lisozima. Al mismo tiempo, calentar para destruir la pared exterior de las bacterias ayuda a desemparejar las bases de la cadena de ADN y desnaturaliza las proteínas y el ADN cromosómico. Después de bajar la temperatura, el ADN de círculo cerrado forma moléculas superenrolladas que permanecen en el sobrenadante después de la centrifugación.
Extracción con fenol/cloroformo para eliminar proteínas, y luego etanol o isopropanol para precipitar el ADN
Adsorción específica de ADN a través de la membrana de adsorción en la columna de centrifugación
A través La modificación de la superficie de las perlas magnéticas (matriz de sílice) adsorbe específicamente los ácidos nucleicos
Principio de detección:
Ventajas: operación fácil y rápida
Desventajas: no se puede distinguir entre ADN y Las impurezas como el ARN, los ácidos nucleicos degradados y los nucleótidos libres pueden conducir fácilmente a concentraciones falsamente altas
Instrumentos de uso común: Nanodrop, Onedrop
Principio de detección: uso de tintes fluorescentes y moléculas diana específicas Se une y emite fluorescencia, lo que permite que el instrumento reciba ácidos nucleicos específicamente adsorbidos. Los tintes fluorescentes emiten fluorescencia después de unirse a moléculas objetivo específicas, y el instrumento recibe el valor de fluorescencia y lo convierte en datos de concentración.
Ventajas: alta sensibilidad, fácil operación
Desventajas: alto costo y costoso; no se puede distinguir directamente los ácidos nucleicos degradados
OD260: absorbancia de los ácidos nucleicos
OD280: absorbancia de la proteína
OD260/OD280 = 1,7-1,9 significa que la pureza de la prueba es muy buena
OD260/OD280 = 1,7-1,9 significa la pureza de la prueba es muy buena
OD260/OD280 <1.7 indica que puede haber residuos de proteínas
OD260/OD280 >1.9 indica que el ADN puede estar parcialmente degradado Se recomienda realizar. pruebas de integridad o detectar si hay residuos de ARN
Detectar si hay residuos de ARN y proteínas. 1%-2% de agarosa, 1-3ul de muestra
Para determinar si hay degradación del ADN. 1%-2% de agarosa, 1-3ul de muestra
Determinar la degradación del ADN: 1-2% de agarosa, 1-3ul
Determinar las bandas de ADN en imágenes de gelatina
p>La banda de ADN genómico intacta es única y brillante, sin colas ni dispersión.
Diferentes grados de degradación darán lugar a diferentes grados de colas o dispersión en la imagen del gel. Cuanto más grave es la degradación, más evidente es la dispersión y menor es el tamaño del fragmento.
Almacenamiento: Se recomienda almacenar el ADN en paquetes separados y evitar la congelación y descongelación repetidas del ADN para no afectar la integridad del ADN.
Solución de conservación:
Almacenamiento a corto plazo: para experimentos posteriores con requisitos de concentración de iones más altos: agua estéril con un valor de pH ligeramente alcalino.
Para requisitos de baja concentración de iones--tampón TE (Tris, EDTA).
Almacenamiento a largo plazo: etanol.
Temperatura de almacenamiento: -20°C/-80°C para almacenamiento a largo plazo, preferiblemente a 4°C durante no más de 14 días.
1. Intente elegir muestras frescas para reducir el impacto de las enzimas endógenas.
2. Al almacenar muestras, trate de evitar la congelación y descongelación repetidas de las muestras.
4. Elija un método de tratamiento adecuado y realice un pretratamiento de muestra adecuado
5. Agregue tampón de lisis después del pretratamiento de la muestra y antes de descongelarla. Agregue la solución de lisis antes de descongelar la muestra
6. Lise completamente la muestra
7. Agregue los reactivos necesarios y la dosis de reactivo correctamente. Cuando el volumen de la muestra aumente, duplique la solución de lisis
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8. Separe y conserve los productos de ADN, evite la congelación y descongelación repetidas y el tiempo de almacenamiento no debe ser demasiado largo.
1. Conozca de antemano el contenido de ADN de la muestra extraída. 2. Cuando el ADN de la muestra se degrada, el rendimiento disminuirá
3. Elija métodos de pretratamiento y lisis adecuados (como extender el tiempo de lisis y precipitación del ADN, etc.) para liberar la mayor cantidad de ADN. como sea posible ADN en la muestra
4. Cuando utilice el kit de columna cromatográfica para eluir el producto de ADN, intente cubrir toda la membrana de adsorción; la segunda elución también puede aumentar la cantidad de ADN en la muestra; La segunda elución también puede aumentar la cantidad de ADN en la muestra. Cuando utilice un kit de columna cromatográfica para eluir el producto de ADN, intente cubrir toda la membrana de adsorción; la elución secundaria también puede mejorar el rendimiento.
5. Cuando utilice el método de precipitación para extraer ADN, puede agregar 1/ 10 volúmenes de acetato de sodio (PH5.2) para ayudar a precipitar el ADN
1. No poner demasiado en la muestra, porque demasiadas impurezas aumentarán y la lisis posterior no será completa
2. Las muestras deben estar completamente lisadas, especialmente los residuos de ARN: utilice RNasa para tratar el ARN y el tiempo de procesamiento no debe ser demasiado corto (unos 5 minutos)
4. Residuos de proteínas: utilice un desnaturalizante de proteínas o proteinasa K
Al aspirar el sobrenadante (ADN) en el método de precipitación en capas, tenga cuidado de no aspirar la proteína precipitada en la capa inferior. Aspirar la proteína precipitada en la capa inferior
1. Añadir reactivos para evitar la oxidación fenólica en la solución de extracción: β-mercaptoetanol, ácido ascórbico, cisteína, ditiotreitol, etc.
2 Agregue reactivos que sean fáciles de combinar con sustancias fenólicas: como PVP (polivinilpirrolidona), que tiene una mayor afinidad con las sustancias fenólicas y puede evitar que las sustancias fenólicas se unan al ADN
1. Método con alto contenido de sal: uso. alta concentración de Na+, Na+, Na+, Na+, Na+, Na+ o proteinasa K para extraer ADN del sobrenadante. Las altas concentraciones de Na+ y K+ cambian las características de solubilidad de los polisacáridos, haciendo que se separen de la fase acuosa y entren en la fase orgánica, y luego los eliminan con el método de extracción simulada con fenol
2. Etanol de baja concentración y Las soluciones de acetato de potasio pueden eliminar los polisacáridos.
3. Las sustancias PVP/PVPP también tienen cierto efecto en la eliminación de polisacáridos.
1. Número de copias del plásmido
Plásmidos de baja copia: pBR322, pACYC y sus derivados, pSC101 y sus derivados, SuperCos, pWE15, etc.
Plásmidos de alta copia: pTZ, pUC, pBS, pGM-T, etc.
Los plásmidos con pocas copias pueden aumentar adecuadamente la cantidad de muestra entrante
2. Problemas de cepa: tiempo de almacenamiento, detección de resistencia
Si el tiempo de almacenamiento es demasiado largo, el plásmido se ha perdido antes de extraer el plásmido. En este momento, se puede seleccionar la activación y el recubrimiento del cultivo en placa y luego seleccionar nuevas colonias para el cultivo líquido.
3. Elija los métodos de pretratamiento y lisis adecuados para liberar completamente el ADN en el. muestra la mayor cantidad posible
4. Utilice columnas Utilice el kit de columnas para elución
5. Utilice el kit de columnas para elución
6. Utilice el kit de columnas para elución
7. Utilice el kit de columna para elución. Realice la elución.
8. Intente utilizar el kit de columna para eluir el producto de ADN. Cuando utilice el kit de columna para eluir el ADN. producto, debe intentar cubrir toda la membrana de adsorción. La segunda elución también puede mejorar el rendimiento
1. Tiempo de recolección de cepas
Para las cepas antiguas, la cantidad de plásmidos abiertos fue significativamente mayor. que el de las cepas en la fase de crecimiento logarítmico.
Encuentre la fase logarítmica de crecimiento según el crecimiento de la cepa utilizada. En términos generales, la fase de crecimiento logarítmico se refiere al período en el que la tasa de crecimiento constante es mayor y el tiempo de generación de división celular es el más corto.
2. El contenido de enzimas intracelulares de la bacteria huésped debe ser alto.
3. El tiempo de desnaturalización y lisis no debe ser demasiado largo, de lo contrario también afectará la integridad del plásmido.
4. Se debe agregar solución neutralizante durante la lisis alcalina, y la operación debe ser suave (el tiempo de lisis no debe exceder los 5 minutos)
Existen tres tipos de impurezas
1. Residuo de ARN
Utilice RNasa para digerir el ARN
2. Residuos de ADN genómico
Operar suavemente
Durante el Durante el proceso de lisis o neutralización, el ADN genómico puede romperse debido a una operación demasiado vigorosa.
3. Residuos de proteínas
Utilice proteína desnaturalizante o proteinasa K para la digestión.
Alcalina. lisis.Coloque el sistema de neutralización a 4 °C durante un período de tiempo. Precipitan menos residuos de proteínas.
Neutralice de manera uniforme y completa para combinar completamente las proteínas con los reactivos.
4.