¿Por qué la hibridación Southern utiliza una solución con alto contenido de sal?

La hibridación Southern generalmente utiliza hibridación líquido-sólido, es decir, la sonda está en fase líquida y el ADN hibridado está en fase sólida. La hibridación ocurre en una solución (solución de hibridación) bajo ciertas condiciones y requiere una temperatura determinada. Se pueden utilizar botellas de hibridación o bolsas de hibridación y el líquido puede fluir continuamente sobre la membrana. Puedes hacer la mezcla tú mismo o comprarla en una empresa. Las fórmulas de diferentes soluciones de hibridación son muy diferentes y las temperaturas de hibridación también son diferentes. La siguiente es la fórmula de la solución de mezcla: PEG 6000 10 %; SDS 0,5 %; 6 x SSC; 50 % de formamida.

1. Prehibridación

Remoje la membrana NC en 2×SSC durante 5 minutos, agregue la solución de hibridación (5 ml para una membrana de 8 cm × 8 cm) a la botella de hibridación y retire la parte posterior. de la membrana, fíjelo a la pared de la botella de hibridación, con la parte frontal hacia la solución de hibridación. Póngalo en un horno de hibridación a 42 °C y aumente la temperatura del sistema de hibridación a 42 °C. Desnaturalice el ADN del esperma de salmón roto por ultrasonidos (disuelto en 5 minutos de agua o TE) a 65438 ± 000 °C durante 5 minutos y agréguelo rápidamente. a la botella de hibridación su concentración alcanza 65438±000μg/ml. Continuar la hibridación durante 4 horas. La función del ADN del esperma de salmón es bloquear los sitios de la membrana NC donde no se transfiere el ADN, reducir el fondo de hibridación y mejorar la especificidad de la hibridación.

Crossover

Vierta la solución de hibridación prehibridada, reemplácela con una cantidad igual de solución de hibridación nueva que se haya calentado a 42 °C y agregue ADN de esperma de salmón desnaturalizado a al mismo tiempo. Calentar la sonda a 100°C durante 5 minutos para desnaturalizarla y agregarla rápidamente a la botella de hibridación. Hibridar durante la noche a 42°C.