¿Cuáles son los métodos de detección para los productos de PCR? ¿Cuál es el principio?
Electroforesis en gel de agarosa
Este es el método más utilizado en el laboratorio. Es simple y fácil de realizar. El experimento solo requiere una pequeña cantidad de. ADN. El principio es que cuando las moléculas de ADN de diferentes tamaños pasan a través del gel de agarosa, se separan debido a las diferentes velocidades de nado. Se tiñen con bromuro de etidio (EB) y las moléculas de ADN emiten fluorescencia bajo luz ultravioleta, determinando así su tamaño molecular. ?
La concentración de agarosa utilizada para la detección por electroforesis de productos de PCR suele ser 1-2. Se debe utilizar agarosa de grado de electroforesis de alta pureza y se han eliminado impurezas como inhibidores de fluorescencia y nucleasas.
(1) Fabricación de gel
El espesor del gel de agarosa es de aproximadamente 3 ~ 5 mm. Si es demasiado delgado, la muestra se desbordará. Si es demasiado grueso, la fluorescencia. La penetración no será fuerte, por lo que algunas bandas pequeñas de ADN son difíciles de distinguir. Si se preparan 100ml de gel 2, pesar 2g de agarosa en un matraz Erlenmeyer y añadir 100ml? Solución 0,5 × TBE, calentar en el microondas durante 2-5 minutos para disolver completamente la agarosa (tenga cuidado de no hervir). Cuando la temperatura ambiente descienda a 60 °C, agregue la solución de EB con una concentración final de 0,5 μg/ml, mezcle bien y vierta la placa (tenga cuidado de no desgasificar).
(2) Adición de muestra y electroforesis
Al cargar la muestra, generalmente tome de 5 a 10 μl de solución de reacción de PCR, agregue 3 μl de solución de azul de bromofenol, mezcle y agregue al orificio de carga del gel. El instrumento de electroforesis puede ser un instrumento de electroforesis de voltaje medio ajustable y estabilizado de uso general, y el fluido de trabajo de la electroforesis es una solución de 0,5 × TBE. Cuando se conecta la alimentación, la muestra se mueve del electrodo negativo al electrodo positivo. La electroforesis de voltaje constante de 60-100 V tarda entre 30 y 60 minutos.
(3) Detección
Coloque la placa de gel en la platina de vidrio del transmisor UV para la detección. El producto de ADN y el tinte fluorescente EB forman un complejo fluorescente de color amarillo anaranjado. Observe si hay una banda fluorescente naranja en cada carril y compárela con el control positivo establecido durante la amplificación para determinar el resultado positivo o negativo. El uso del peso molecular estándar como control durante la electroforesis también puede determinar si el fragmento amplificado es consistente con el tamaño diseñado.
Electroforesis en gel de poliacrilamida
La electroforesis en gel de poliacrilamida es más compleja que la electroforesis en gel de agarosa, pero a menudo se utiliza para la purificación de cebadores, huellas dactilares de amplificación por PCR y amplificación por PCR múltiple y polimorfismo de longitud de restricción. análisis de productos de amplificación por PCR.
El rango efectivo de electroforesis en gel de poliacrilamida para separar fragmentos de ADN:
(1) Preparación del gel
Coloque una almohadilla entre dos placas de vidrio para fabricar gel, Coloque el marco para hacer pegamento, apriete los tornillos para hacer pegamento y sujete la placa de vidrio.
Preparar una cantidad adecuada de gel con la concentración adecuada, un poco más que la placa de gel. Consulte la siguiente tabla para la preparación de geles de 100 µl de volumen. ?
Preparación de geles de poliacrilamida de diferentes concentraciones:
Después de añadir TEMED y persulfato de amonio 10, mezclar inmediatamente y verter en un recipiente de vidrio colocado en un ángulo de 45°C. con cuidado de que no queden burbujas de aire) y rápidamente coloque la placa de vidrio en posición horizontal. Coloque inmediatamente el peine moldeador encima de la cavidad y sujételo. Después de que el gel se polimerice durante 30 a 60 minutos, retire la placa de gel y colóquela en el tanque de electroforesis para fijarla.
(2) Adición de muestra y electroforesis
Agregue 1 × tampón de electroforesis TBE a los tanques superior e inferior, desborde el orificio de muestreo, saque el peine y descargue las burbujas de aire en el orificio de muestreo. Mezcle el producto de PCR o el producto de digestión con endonucleasa de restricción 2 con el tampón de carga 1 y agréguelo al fondo del pozo de carga usando una microjeringa para que la muestra forme una capa en el fondo del pozo. Agregue ADN de peso molecular estándar a los pocillos de ambos lados. Marcar con bolígrafo.
Realice la electroforesis a un voltaje de 2-10 V/cm, y el tiempo de electroforesis es lo suficientemente largo para separar los fragmentos. Cuando el indicador alcance la posición adecuada, apague la alimentación y retire la película.
(3) Tinción de plata
Separar las dos placas de vidrio, colocar el trozo de gel en 100 ml de fijador de tinción de plata, agitar bien durante 15 minutos, evaporar dos veces y lavar 3 veces cada una. tiempo 2 minutos y luego transferir el trozo de gel a 100 ml? Teñir con 0,2 AgNO3 en una mesa agitadora durante aproximadamente 65438 ± 00 minutos, absorber la solución de AgNO3, lavar 3 veces con agua bidestilada, 30 s cada vez, agregar 65438 ± 000 ml de solución cromogénica durante aproximadamente 7-65438 ± 00 minutos, esperar hasta que La banda de ADN es transparente, absorba la solución cromogénica, agregue la solución fijadora Na2CO3, déjela reposar durante 2-3 minutos y luego sáquela.