¿Cómo recuperar y purificar el gen diana mediante electroforesis en agarosa después de la amplificación por PCR? Espero que los expertos puedan darme algún consejo!

El ADN se recupera utilizando el kit de recuperación de gel de ADN AxyPrep de AXYGEN. Los pasos de recuperación son los siguientes:

1. Corte el gel de agarosa que contiene el ADN objetivo bajo luz ultravioleta. Pegamento ligero, use toallas de papel para absorber el líquido en la superficie del gel y córtelo en pedazos. Calcule el peso del gel (registre el peso del tubo de centrífuga de 1,5 ml con anticipación) y considérelo como el volumen del gel (por ejemplo, 100 mg = 100 μl de volumen);

2. Agregue 3 veces el volumen del gel. de tampón DE-A. Mezclar bien y calentar a 75°C, revolviendo intermitentemente (cada 2-3 minutos) hasta que el bloque de gel se derrita por completo (aproximadamente 6-8 minutos);

3. tampón DE-B, mezclar

4. Aspirar la solución mezclada en el paso 3, transferir al tubo de preparación de ADN (colocarlo en el tubo de centrífuga de 2 ml provisto en el kit), centrifugar a 12000×g. durante 1 min y desechar el filtrado;

5. Vuelva a colocar el tubo de preparación en el tubo de centrífuga de 2 ml, agregue 500 μl de tampón W1, centrifugue a 12000 xg durante 30 s y deseche el filtrado;

6. Vuelva a colocar el tubo de preparación en el tubo de centrífuga de 2 ml, agregue 500 μl de tampón W2, 12000 × g durante 30 s, deseche el filtrado y lave nuevamente con 700 μl de tampón W2 a 12000 × g. durante 1 min; el mismo método;

7. Colocar el tubo de preparación nuevamente en el tubo de centrífuga de 2 ml y centrifugar a 12000 × g durante 1 minuto;

8. tubo de preparación en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml (incluido en el kit) y transfiéralo a la membrana de preparación. Agregue 25-30 µl de diluyente al centro, déjelo reposar a temperatura ambiente durante 1 minuto y centrifugue a 12.000 xg durante 1 minuto. min para eluir el ADN.

Si los fragmentos son relativamente grandes, como de más de unos pocos miles de kb, se recomienda utilizar el kit de recuperación de Promega, que tiene mejores resultados.

El kit de reciclaje contiene instrucciones paso a paso.