¿Cuál es la diferencia entre tú y yo? ¿Lo estás usando aquí?

La frase correcta debería ser: ¿Cuál es la diferencia entre tú y yo?

No puedes usar are, debes usar is, porque el siguiente diferente es singular y es el sujeto real, y su predicado debe usarse is.

Entre tú y yo no hay un sujeto, sino un adverbial.