Comparación de varias tecnologías de hibridación de ácidos nucleicos Principios y procedimientos experimentales de hibridación de puntos
También se introducen los conceptos básicos y los principios y métodos experimentales de la hibridación de puntos. 0?2 ¿Comparación de varias técnicas de hibridación de ácidos nucleicos? 0?2 Principios y procedimientos experimentales de hibridación de puntos
(1) Similitudes y diferencias de varias hibridaciones de ácidos nucleicos
La hibridación de ácidos nucleicos es una parte de la biología molecular La tecnología básica también es un método común en la investigación genética y el diagnóstico genético. Existen muchas formas de hibridación de ácidos nucleicos, entre las cuales las más utilizadas son la hibridación Southern, la hibridación Northern, la hibridación in situ, la hibridación puntual, etc. Aunque existen varias formas, todas se basan en el principio de complementariedad de bases de las moléculas de ácido nucleico. Desde la perspectiva de los materiales de hibridación, la hibridación se divide en hibridación ADN-ADN, hibridación ADN-ARN e hibridación ARN-ARN. Desde la perspectiva del estado molecular híbrido, la hibridación se divide en hibridación fase líquida-fase sólida e hibridación fase líquida-fase líquida.
Todas las hibridaciones mencionadas anteriormente pertenecen a la hibridación en fase líquido-sólida, es decir, una molécula que participa en la hibridación se fija sobre un soporte de fase sólida y la otra molécula participa en la hibridación en el forma de fase líquida. Una de las dos moléculas que participan en la hibridación debe marcarse para generar una señal de hibridación que pueda detectarse; en la hibridación en fase líquido-sólida, las moléculas en fase líquida a menudo se marcan, de modo que se puedan generar señales diferenciales significativas. En la hibridación, la molécula marcada se denomina sonda y la molécula que se hibrida con la sonda se denomina muestra detectada (molécula detectada). En la mayoría de las hibridaciones en fase líquido-sólido, la muestra que se va a analizar suele ser una molécula mixta, como ADN o ARN genómico extraído de un determinado tejido, y la muestra que se va a analizar se fija en un soporte, mientras que la sonda suele ser una sola. molécula, como ciertos fragmentos de genes. El resultado de la hibridación se juzga en función de la fuerza y la posición de la señal, como el peso molecular (o longitud) de la molécula probada, la intensidad de expresión de la molécula probada, etc. Esta hibridación es adecuada para la detección del mismo fragmento de gen en diferentes muestras. Si una muestra se analiza con diferentes fragmentos de genes, se debe adoptar el método inverso, es decir, los diferentes fragmentos de genes se fijan en el soporte y la muestra a analizar se convierte en una fase líquida y se etiqueta. Este método inverso se denomina hibridación inversa y la muestra marcada en la hibridación inversa también se puede denominar sonda.
En la hibridación en fase líquida-sólida, el portador de fase sólida a menudo utiliza una membrana de nailon o una membrana de acetato de celulosa. Estos materiales especialmente tratados tienen una fuerte fuerza de adsorción en las moléculas de ácido nucleico y no se caen fácilmente durante la operación. Las etiquetas de las sondas suelen utilizar etiquetas radiactivas, como 32P, 35S, etc. Debido a los peligros de las sustancias radiactivas, ahora también se utilizan ampliamente etiquetas no radiactivas, como el marcado con biotina, el marcado con digoxigenina, etc. En términos generales, los marcadores radiactivos son adecuados para la hibridación Southern, la hibridación Northern y la hibridación de puntos, y los marcadores no radiactivos son adecuados para la hibridación in situ. Los marcadores radiactivos tienen alta sensibilidad, amplio rango lineal y los marcadores no radiactivos tienen una fuerte localización, no se desintegran y causan poco daño.
(2) El concepto de dot blot
Dot blot es un método de hibridación en el que la señal de hibridación aparece como manchas. En funcionamiento, se detecta una de las moléculas que participan en la hibridación. sobre la membrana. Dado que las moléculas hibridadas no han sido sometidas previamente a separación electroforética como la hibridación Southern y la hibridación Northern, y a diferencia de la hibridación in situ, las moléculas en un lado de la hibridación ya han mostrado la especificidad de ubicación de la distribución de las células del tejido, por lo que los resultados de la hibridación puntual están completamente determinados por la señal de hibridación. La fuerza de la hibridación no es tan informativa como otras formas híbridas. Sin embargo, el funcionamiento de la hibridación de puntos es relativamente simple, los resultados son intuitivos y es adecuado para la detección de una gran cantidad de muestras, por lo que también se ha utilizado ampliamente en muchos aspectos.
1. Propósito del experimento
Comprender los principios de la hibridación de ácidos nucleicos; estar familiarizado con los métodos generales de hibridación de ácidos nucleicos y dominar la tecnología de hibridación de puntos de membrana y el análisis de resultados.
2. Principio experimental
La hibridación de puntos es una técnica relativamente simple en la hibridación de ácidos nucleicos. Es esencialmente un proceso en el que las moléculas de ácido nucleico monocatenarias forman ácidos nucleicos bicatenarios. complementación de bases. Cuando se marca una molécula monocatenaria, se puede detectar su molécula complementaria.
(1) Blot Blot consiste en fijar las moléculas de un lado de la hibridación en la membrana. Para la hibridación Southern y la hibridación Northern, a menudo se utilizan la transferencia capilar, la transferencia al vacío o la electrotransferencia para lograr la separación electroforética. las moléculas de ácido se "imprimen in situ" en la membrana, mientras que la hibridación de puntos puede utilizar métodos de manchado artificial para fijar las moléculas de ácido nucleico en la membrana. Al dispensar la película, también se utilizan otros métodos para fijar las moléculas de ácido nucleico (como dispositivos dispensadores de película y dispositivos de evacuación por vacío) para unir las moléculas más firmemente a la película y evitar que se difundan.
El proceso de transferencia de hibridación de puntos proporciona una plataforma y una matriz sólidas que permiten que se produzca la hibridación en ubicaciones conocidas.
(2) Etiquetado El etiquetado consiste en hacer que una de las moléculas que participan en la hibridación porte una sustancia identificable de modo que se muestre una señal después de la hibridación. Los marcadores de uso común incluyen isótopos radiactivos y sustancias no radiactivas, y los métodos de etiquetado incluyen etiquetado con cebador aleatorio, traducción de espacios y etiquetado final. En la hibridación en fase líquido-sólida, la etiqueta suele estar en una molécula en fase líquida, lo que convierte a la sonda en la fase móvil. La eficiencia del etiquetado es un factor importante que afecta la hibridación. Dentro de un cierto rango, cuanto mayor sea la actividad específica (que puede entenderse como el número y la actividad de los marcadores en una molécula unitaria), mejor. En la hibridación, las sondas suelen ser excesivas (la intensidad de la señal de hibridación refleja la cantidad de muestra que se analiza y la abundancia de genes), por lo que el método para mejorar la sensibilidad de la hibridación aumentando la cantidad de sondas es muy limitado. actividad.