¿Qué sustancias específicas se incluyen en la tecnología de hibridación molecular? ¿Cuál es la diferencia entre estas tecnologías?
Sondas: Existen muchos métodos de marcaje, los más utilizados son el marcaje con isótopos y el marcaje con biotina. Los métodos de hibridación se pueden dividir en hibridación en fase líquida e hibridación en fase sólida.
Tecnología de hibridación: Actualmente la hibridación en fase sólida es muy utilizada. En este método, la muestra de ácido nucleico monocatenario que se va a detectar (si es bicatenario, debe desnaturalizarse a monocatenario) primero se combina con una membrana de nitrocelulosa y luego se hibrida con una sonda marcada en la solución. Combine electroforesis y autorradiografía para obtener un patrón de hibridación, que luego puede analizarse cualitativa o cuantitativamente. La hibridación molecular se utiliza ampliamente en bioquímica y biología molecular como medio para detectar e identificar las secuencias de bases de fragmentos de ácidos nucleicos. Se ha utilizado en el campo médico para diagnosticar enfermedades infecciosas causadas por ciertos virus o bacterias. También se puede utilizar en ingeniería genética. El proceso de combinar subunidades de diferentes fuentes de proteínas también puede denominarse hibridación.
En la hibridación molecular en fase líquida, las moléculas de ácido nucleico de ambas fuentes están en solución y pueden moverse libremente, y una de ellas suele estar marcada con un isótopo. El análisis de los datos cinéticos de renaturalización puede revelar una descripción general de la estructura del genoma eucariota, como el contenido y la distribución de varias secuencias repetitivas. En la hibridación molecular en fase sólida, una molécula de ácido nucleico está inmovilizada en un medio insoluble y la otra molécula de ácido nucleico está en solución, y las moléculas de ácido nucleico en los dos medios pueden entrar en contacto libremente entre sí. Los medios comúnmente utilizados incluyen filtros de nitrocelulosa, columnas de hidroxiapatita, geles de agar y poliacrilamida. Al principio, la hibridación molecular utilizando agar como medio fijo se utilizaba para determinar la homología del ADN bacteriano y humano.
(1) Hibridación en fase sólida
Primero, la cadena de ácido nucleico que participa en la reacción se fija sobre un soporte sólido y el ácido nucleico de la reacción queda libre en la solución. Los soportes sólidos incluyen filtros de nitrocelulosa, membranas de nailon, partículas de látex, perlas magnéticas y microplacas. La hibridación en fase sólida es la más utilizada debido a sus ventajas, como fácil lavado y eliminación de fragmentos libres no hibridados, fácil detección de híbridos que quedan en la membrana y prevención de la autorrecuperación del ADN objetivo. Los tipos de hibridación en fase sólida comúnmente utilizados incluyen hibridación in situ de colonias, hibridación por transferencia puntual, hibridación por ranura, hibridación por transferencia Southern, hibridación por transferencia Northern, hibridación in situ de tejido e hibridación en sándwich.
(2) Hibridación en fase líquida
Las dos cadenas de ácido nucleico que participan en la reacción quedan libres en la solución. Uno de los primeros tipos de hibridación estudiados y operativamente complejos, aunque a veces se utiliza durante los últimos 30 años, no es tan común como la hibridación en fase sólida. La principal desventaja es que es difícil eliminar el exceso de sonda no hibridada en la solución después de la hibridación y el error es grande. En los últimos años, la mejora continua de la tecnología de detección de hibridación y la aplicación práctica de kits de diagnóstico de sondas genéticas comerciales han promovido el rápido desarrollo de la tecnología de hibridación en fase líquida.
Editar esta sección Hibridación molecular de ácido nucleico de membrana en fase sólida (1) Hibridación in situ de colonias
(Clon hibridación in situ)
Transferir bacterias del cultivo placa para En un filtro de nitrocelulosa, las colonias en el filtro luego se lisan para liberar el ADN, que luego se seca y se fija en la membrana y se hibrida con una sonda marcada con 32P. La señal de hibridación de las colonias se detectó mediante autorradiografía y se comparó con las colonias de la placa.
(2) Hibridación de puntos
(dot blot)
El método consiste en colocar la muestra de prueba en la membrana y hornearla para fijarla. Este método es breve y requiere mucho tiempo, se puede utilizar para análisis semicuantitativos y puede detectar varias muestras simultáneamente en una membrana. Para un muestreo preciso y conveniente, existen muchos colectores en el mercado, como Minifold I y II, Bio-Dot (Bio-Rad) e Hybri-Dot, todos los cuales tienen muchos orificios. Cuando se agrega la muestra al pozo, fluirá hacia la membrana en forma de puntos o hendiduras bajo presión negativa. Enjuague el orificio de inyección repetidamente, retire la membrana y hornee o fije la muestra con irradiación ultravioleta. La membrana ahora está lista para la hibridación.
(3) Hibridación del Sur
(lotería del Sur)
Es la tecnología básica para el estudio de perfiles de ADN. Se utiliza en diagnóstico genético, análisis de perfiles de ADN. Análisis de productos PCR de gran valor.
El método básico es digerir la muestra de ADN con una enzima de restricción, luego usar electroforesis en gel de agarosa para separar los fragmentos enzimáticos, luego desnaturalizar con álcali, neutralizar con tampón Tris y transferir el ADN del gel a un filtro de nitrocelulosa (membrana de nailon). también se utiliza durante mucho tiempo), seco y fijado para la hibridación. La posición relativa de los fragmentos de ADN en el gel se mantiene durante la transferencia al filtro. El ADN adherido a la membrana del filtro se hibrida con una sonda marcada con 32P, y la posición de cada banda de ADN complementaria a la sonda se determina mediante autorradiografía, de modo que la posición y ubicación de los fragmentos de ADN que contienen secuencias específicas en muchos digestos enzimáticos se pueden determinar. tamaño determinado.
(4)Hibridación Northern
(transferencia Northern)
La tecnología de transferencia Southern fue fundada por Southern en 1975 y se llama tecnología de transferencia Southern. Las transferencias Northern se denominan hibridación por transferencia Northern porque corresponden al ADN, y las transferencias Western basadas en principios similares se denominan transferencias Western. La hibridación por transferencia Northern es similar a la hibridación por transferencia Southern, excepto que el ARN se desnaturaliza con óxido de metilmercurio, glioxal o formaldehído antes de la inyección en lugar de NaOH, que hidroliza el grupo 2'-hidroxilo del ARN. Una vez desnaturalizado el ARN, es más fácil unirse a la membrana de nitrocelulosa durante el proceso de transferencia. También se puede transferir con un alto contenido de sal, pero no se unirá firmemente a la membrana antes del horneado, por lo que la membrana no se puede lavar con un tampón bajo en sal después de la transferencia; de lo contrario, el ARN se eluirá. No se puede agregar EB al gel porque afecta la unión del ARN a la membrana de nitrocelulosa. Para determinar el tamaño del fragmento, se puede someter a electroforesis el mismo gel con marcadores agregados y luego se puede cortar, teñir y fotografiar el gel marcador. La muestra de pegamento se transfirió desde el Norte. El método para colorear el pegamento de marcado es remojarlo en 0,1 mol/L de acetato de amonio que contiene 5 μg/ml de EB en un cuarto oscuro durante 10 minutos y luego decolorarlo en agua. Al tomar fotografías con la cámara de imágenes principal bajo luz ultravioleta, el gel de ARN coloreado debe tener una exposición mínima a la luz ultravioleta. Si se expone a demasiada luz ultravioleta o durante demasiado tiempo bajo iluminación incandescente, la señal de ARN se debilitará. Al aislar ARNm completamente funcional del gel de agarosa, el hidróxido de metilmercurio es un poderoso desnaturalizante reversible, pero es tóxico, por lo que a muchas personas les gusta usar formaldehído como desnaturalizante. Todas las operaciones deben evitar la contaminación por ribonucleasa.
(5) Hibridación in situ de tejidos
(Hibridación intra-tejido)
Abreviada como hibridación in situ, se refiere a la hibridación in situ de tejidos o células, que es diferente de la hibridación in situ de colonias. La hibridación in situ de colonias requiere lisar bacterias para liberar ADN y luego hibridar. Después del tratamiento adecuado, la hibridación in situ aumenta la permeabilidad celular y permite que las sondas se hibriden con ADN o ARN. Por lo tanto, la hibridación in situ puede determinar la ubicación espacial de la secuencia complementaria de la sonda en las células, lo que tiene un importante significado biológico y patológico. Por ejemplo, la hibridación in situ de ADN cromosómico denso se puede utilizar para mostrar la ubicación de secuencias específicas; la hibridación de ADN nuclear durante la división puede estudiar la disposición funcional de secuencias específicas en la cromatina; la hibridación con ARN celular puede analizar con precisión la ubicación de cualquier ARN; en células y tejidos distribuidos. Además, la hibridación in situ también es una técnica importante para mostrar la distribución y tendencias de subpoblaciones celulares y la presencia y ubicación de microorganismos patógenos.
La sonda utilizada para la hibridación in situ puede ser una sonda de ADN o ARN monocatenaria o bicatenaria. La longitud de la sonda suele ser de 100 ~ 400 nt. Si es demasiado larga, se reducirá. la eficiencia de hibridación. Los resultados de investigaciones recientes muestran que las sondas de oligonucleótidos (16 ~ 30 nt) pueden entrar y salir libremente de las paredes celulares de bacterias y tejidos, y la eficiencia de hibridación es significativamente mayor que la de las sondas largas. Por lo tanto, las sondas de oligonucleótidos y las pequeñas sondas de ADN marcadas con PCR asimétrica o las sondas de ARN marcadas con transcripción in vitro son sondas preferidas para la hibridación tisular in situ.