La diferencia entre perlas inmunomagnéticas y perlas de agarosa para inmunoprecipitación
La diferencia entre perlas inmunomagnéticas y perlas de agarosa para la inmunoprecipitación
(1) 24-48 horas después de la transfección
h
Las células pueden se recolectará, agregue una cantidad adecuada de tampón de lisis celular (que contenga inhibidores de proteasa) y lise en hielo durante 30 minutos.
Centrifugar el lisado celular a 4 °C a velocidad máxima.
Centrifugar a velocidad máxima 30
Después de 30 minutos, tomar el sobrenadante;
(2) Tomar una pequeña cantidad de lisado para análisis de transferencia Western
y agregue 1 μg del anticuerpo correspondiente al lisado restante en el lisado celular e incube con agitación lenta a 4°C durante la noche;
(3) Tome 10 μl
proteína
p>
Se lavaron perlas de agarosa con una cantidad adecuada de tampón de lisis 3 veces
y se centrifugaron a 3000
rpm durante 3 minutos cada una. tiempo;
( 4) Agregue 10 μl de perlas de agarosa de proteína
A
pretratadas al lisado celular incubado con el anticuerpo durante la noche y agite lentamente a 4 ° C. Incubar durante 2 a 4 horas para acoplar el anticuerpo a la proteína
Perlas de agarosa A;
(5) Después de la reacción de inmunoprecipitación, incubar a 4°C
Centrifugar a 3000
rpm
durante 3
min. Centrifugar las perlas de agarosa hasta el fondo del tubo, aspirar con cuidado el sobrenadante y retirar la agarosa; perlas Lavar 3-4 veces con 1 ml de tampón de lisis; finalmente agregar 15 μl de 2×SDS
Buffer de carga y hervir en agua hirviendo durante 5 minutos;
(6) SDS-. PAGE,
p>Western
análisis por espectrometría de masas o transferencia Western.
Cuestiones a tener en cuenta:
(1) Para la lisis celular se utilizan condiciones de lisis leves, que no pueden destruir todas las interacciones proteína-proteína en las células. Los desnaturalizantes no iónicos (NP40) son. utilizado principalmente o Triton
X-100). Las condiciones de lisis son diferentes para cada tipo de célula y se determinan empíricamente. No se pueden utilizar desnaturalizantes de alta concentración (0,2 SDS) y se deben agregar al lisado celular varios inhibidores enzimáticos, como cócteles comerciales.
(2) Utilizando anticuerpos transparentes, se pueden utilizar varios anticuerpos juntos.
(3) Usar anticuerpo de control: