Al realizar qPCR, la temperatura de los cebadores de referencia internos difiere de la del gen objetivo en aproximadamente 5 grados. ¿Podemos hacerlo juntos?

En términos generales, qPCR MasterMix en tiempo real es una solución concentrada 2 veces y solo es necesario agregar plantillas y cebadores. Debido a la alta sensibilidad de la qPCR en tiempo real, se deben realizar al menos tres pocillos paralelos para cada muestra para evitar que el análisis estadístico sea imposible en análisis de datos posteriores debido a grandes diferencias de Ct o grandes DE. En términos generales, la concentración final de plomo en el sistema de reacción es de 100 a 400 mm; la plantilla es generalmente de 10 ng a 500 de ARN total y 10 veces de ADNc, que debe ajustarse de acuerdo con la abundancia de expresión del gen objetivo. Por supuesto, todos estos son valores empíricos durante la operación, deben optimizarse de acuerdo con el masterbatch, la plantilla y los cebadores utilizados para lograr un sistema de reacción óptimo. Durante el proceso de configuración del sistema de reacción, se deben tener en cuenta los siguientes puntos:

1. MasterMix no debe congelarse ni descongelarse repetidamente. Si se usa con frecuencia, lo mejor es disolverlo y guardarlo a 4 grados centígrados.

2. Haga más mezclas para reducir el error de muestreo. Es mejor hacerlo sobre hielo.

3. ¡Cada tubo o orificio debe reemplazarse por una punta nueva! ¡No utilice la misma punta de pipeta para añadir muestras continuamente!

4. Después de añadir todos los ingredientes, centrifugar para eliminar las burbujas de aire.

5. Cada muestra tiene al menos 3 agujeros paralelos.

Los colorantes de referencia (colorantes pasivos) se suelen utilizar como ROXTM (ahora marca registrada de ABI!) u otros colorantes, siempre y cuando no afecten el valor de fluorescencia del producto de PCR que se está detectando. La función del tinte de referencia es estandarizar las oscilaciones que no son de PCR en reacciones cuantitativas de fluorescencia, corregir errores de carga o errores de pozo a pozo y proporcionar una línea de base estable. Muchas empresas ahora formulan ROXTM en MasterMix o premezcla. Si la curva de reacción es buena o el sistema de reacción se ha optimizado, la calibración se puede realizar sin agregar colorante ROXTM.