¿Conoce realmente su "E. coli"?

Las bacterias en la fase de retraso acaban de ser inoculadas en el medio de cultivo y son metabólicamente activas pero no se dividen. Se están adaptando y ajustando al nuevo entorno. Luego, el cultivo bacteriano entra en la fase de crecimiento logarítmico, donde las bacterias sufren una fisión binaria, duplicando su número en un período de tiempo determinado (por ejemplo, E. coli se reproduce cada 20 minutos en la fase de crecimiento logarítmico). En esta etapa, el crecimiento celular es exponencial y la actividad metabólica es uniforme entre las células. Por ejemplo, las bacterias en esta etapa también son más susceptibles a los efectos de los antibióticos, lo que la convierte en una etapa ideal para la investigación. Cuando la densidad celular en cultivo líquido alcanza su valor máximo, las células entran en la fase estacionaria. En esta etapa, el número total de células no aumenta y las células muertas son reemplazadas por células que se dividen nuevamente, pero el número total de células vivas permanece sin cambios. Si se estudian bacterias formadoras de esporas, esta puede ser la etapa en la que las células vegetativas forman esporas o nuevas esporas. Finalmente, la fase de muerte (o declive) es causada por una variedad de factores, incluida la falta de nutrientes u oxígeno, cambios en el pH del medio de cultivo causados ​​por el metabolismo celular o la acumulación de productos de desecho celulares tóxicos.

Utilice OD600 para determinar la etapa de crecimiento de un cultivo bacteriano:

Mida OD600, ¿es decir? La densidad óptica (OD) a 600 nm es la forma más sencilla de medir la etapa de crecimiento de cultivos bacterianos. La densidad óptica mide el grado de dispersión de la luz causada por las bacterias en un cultivo; cuantas más bacterias hay, más dispersa está la luz. La longitud de onda de 600 nm se utiliza específicamente para medir la DO de las bacterias porque, a diferencia de las longitudes de onda UV, 600 nm no es perjudicial para los cultivos. Esta longitud de onda generalmente no es absorbida por medios amarillos como TSB (caldo de soja tríptico) y LB (caldo lisogénico). Al detectar OD600, puede determinar en qué etapa se encuentra el cultivo.

Entonces, ¿cómo medirlo? Para suspensiones celulares simples, primero es necesario poner a cero el espectrofotómetro con medio nuevo y sin semillas para reducir la absorción de cualquier medición por parte del medio. Luego, tome una muestra de cultivo y mídala. Notas de medición: 1. Al tomar el cultivo, asegúrese de mezclarlo bien y medirlo inmediatamente, ya que las células pueden comenzar a precipitar en aproximadamente un minuto, lo que dará lugar a resultados inexactos. 2. Si sus bacterias forman una biopelícula o un agregado en la solución, afectará seriamente la exactitud y precisión de sus mediciones. En este caso, es posible que necesite sonicar o procesar más el cultivo para alterar estos agregados. Este problema se puede resolver revisando la literatura. Lo más importante es que si el valor de OD es mayor que 1, ¡los resultados serán inexactos! Lecturas de DO tan altas están más allá del rango dinámico de la mayoría de los espectrofotómetros, lo que significa que las lecturas no aumentan linealmente al aumentar la concentración celular. Si su DO es superior a 1, diluya 2 veces más hasta alcanzar una DO600 inferior a 1.

OD600 no es un valor absoluto:

El valor OD representa la cantidad de luz dispersada por la muestra. Sin embargo, este valor se ve afectado por la intensidad del haz y el diseño de especificaciones del instrumento. Esto significa que muestras similares tendrán valores de OD completamente diferentes bajo diferentes instrumentos (porque los instrumentos tienen diferentes lámparas), e incluso si las especificaciones son las mismas, la intensidad del haz disminuirá a medida que se usa la lámpara. Por lo tanto, no tiene sentido registrar el valor de OD en el manual experimental, ya que este número depende tanto del instrumento como de la densidad del cultivo.

Calcule la densidad celular a partir de OD600:

Si desea conocer la densidad celular a partir de la lectura de OD600, como el número de células/mL, debe hacer una curva estándar de aproximadamente la relación lineal entre el número de celdas y OD600. Las células primero se cultivaron en suspensión y luego se diluyeron para obtener una serie de muestras cuyos valores de DO se diluyeron a 2, 1, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2 y 0,1 respectivamente. (Nota: no utilice diluciones en serie ya que son muy inexactas). Para cada diámetro exterior, es necesario conocer la densidad celular en células/ml. Diluya cada OD a 107, 106 y 105 respectivamente, aplique una cantidad adecuada en la placa de cultivo sólido y luego déjela crecer. Luego se calcula el número de colonias formadas en el diluyente más adecuado y se multiplica por el factor de dilución.

También cabe señalar que el valor de DO de la muestra depende del tamaño y la forma de las partículas de la muestra, y la relación entre el valor de DO y las células/mL en diferentes líneas celulares no es exactamente la misma. mismo. Esto significa que cada tipo de batería utilizada debe calibrarse individualmente.

Utilice sus ojos para estimar la OD600: las bacterias a menudo se cultivan en matraces y es necesario entrenarse para estimar los valores de OD con los ojos. Si el OD es claramente insuficiente, se puede omitir la inspección del OD600, ahorrando un tiempo valioso. Aunque no puede reemplazar completamente al OD600, puede reducir la cantidad de mediciones.

Otros métodos de seguimiento del crecimiento y metabolismo de cultivos bacterianos: Examinando el cultivo al microscopio, se puede estimar la concentración aproximada de células viables en el cultivo. Como beneficio adicional, puede comparar imágenes de células para ver si cada lote de células tiene una morfología diferente o cuántas células vegetativas hay en el cultivo de esporulación.

Oxígeno disuelto y dióxido de carbono: En algunos experimentos de fermentación microbiana se consume oxígeno (O2) y se genera dióxido de carbono (CO2). El mismo proceso ocurre con las bacterias aeróbicas, y en los biorreactores se utilizan comúnmente sondas de oxígeno disuelto y dióxido de carbono. Puede ser detectado por sensores ópticos.

pH: con el tiempo, la mayoría de las bacterias reducirán el pH de su medio de cultivo, incluida E. coli. Para algunas especies, la producción de ácido en realidad limita el crecimiento y la viabilidad máximos del cultivo. El pH en el matraz se puede controlar continuamente.

Azúcar: Utilizar un instrumento específico para detectar el contenido de azúcar residual. Por ejemplo, si la principal fuente de carbono en el medio de cultivo es la glucosa, entonces medir la glucosa durante el crecimiento bacteriano puede indicarnos dónde se encuentra el cultivo en la curva de crecimiento.

Tiempo de recolectar cultura: En definitiva, todo depende del propósito de la cultura. La calidad y cantidad de proteína obtenida de los cultivos depende de la etapa en la que los coseche. Es necesaria una evaluación correcta del tiempo de crecimiento bacteriano.