Gel de electroforesis de agarosa
1. Preparación de ADN.
⑴Adecuado para separar grandes fragmentos de ADN.
El gel de agarosa puede distinguir fragmentos de ADN que difieren en aproximadamente 100 pb. Aunque su resolución es menor que la del gel de poliacrilamida, es fácil de preparar, tiene un amplio rango de separación y es particularmente adecuado para separar grandes fragmentos de ADN. El rango de ADN separado por gel de agarosa común es de 0,2 a 20 kb, y la electroforesis por pulsos puede separar fragmentos de ADN de hasta 10 7 pb.
En el experimento de extracción de ADN total del ensilaje se utilizaron electroforesis en gel de agarosa y métodos de absorción ultravioleta. El ADN extraído es de alta pureza y puede usarse directamente para operaciones moleculares posteriores. Este método de extracción es muy sensible y puede reflejar completamente la apariencia original de los microorganismos en la muestra [1].
En el experimento de "CTAB combinado con un kit de recuperación de gel de ADN para extraer ADN de hongos comestibles", los investigadores utilizaron dos métodos para extraer ADN: uno es el método CTAB (método de control). 2. Método de combinación (método de combinación) de CTAB y kit de recuperación de gel de ADN (kit de ADN en gel de agarosa). Los resultados experimentales muestran que, en comparación con el método de control, las bandas de electroforesis de las muestras de ADN extraídas mediante el método combinado son más regulares y claras, y la eficiencia de la digestión del ADN es significativamente mayor que la del método de control. Esto demuestra que el enfoque combinatorio puede aislar eficazmente ADN puro a partir de materiales ricos en polisacáridos [2].
Se puede extraer ⑵ ADN de macromoléculas.
En el experimento "Investigación de preparación y digestión enzimática de ADN HMW de Burkholderia cepacia", se mencionó que la clave para construir una biblioteca genómica de fragmentos grandes es obtener ADN genómico de alto peso molecular [3]. Sin embargo, utilizando kits comerciales maduros para extraer ADN genómico sólo se puede obtener ADN de aproximadamente 20 kb de tamaño. La extracción enzimática requiere múltiples extracciones para obtener ADN puro, pero provoca fácilmente la fragmentación del genoma y dificulta la obtención de ADN genómico de más de 300 kb. Ninguno de los métodos puede lograr el objetivo, pero después de una incansable investigación por parte de los investigadores, utilizando gel de agarosa para extraer ADN genómico, se pueden obtener fragmentos de ADN lo suficientemente grandes como para cumplir plenamente con los requisitos para construir una biblioteca de genoma cósmido. En este proceso, los investigadores eligieron este último entre los problemas de preparar bloques de gel con agarosa de bajo punto de fusión o agarosa de punto de fusión común, porque la agarosa de bajo punto de fusión es costosa y los bloques de gel son fáciles de romper durante la preparación y purificación. No hay diferencia entre la agarosa de punto de fusión normal y la agarosa de punto de fusión bajo en la preparación de ADN genómico.
1. Detectar productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa.
En la extracción de ADN genómico, el ADN se incuba, se extrae y se precipita, se lava dos veces con etanol 70 y luego se disuelve con una cantidad adecuada de agua bidestilada. Luego realice la electroforesis en un gel de agarosa 1,0 y estime la concentración de la solución de ADN utilizando la escalera de ADN de 1 kb como referencia. El método de prueba específico es el siguiente: use agarosa 2.0 como gel, mezcle 6 microlitros de producto AFLP-PCR con 1 microlitro de tampón de carga y luego cargue la muestra. El tampón de electroforesis es 1 × TBE y el tampón de electroforesis es 120 V. durante 50 minutos. Después de teñir con solución EB, las muestras se observaron y fotografiaron en un sistema de imágenes en gel (ChampGel-3200) [4].
2. Aplicación de la agarosa en otros campos.
⑴Aplicación de la agarosa en el método de inmunodifusión.
El método de inmunodifusión utiliza gel de agarosa como medio de difusión para permitir que los antígenos y anticuerpos se difundan libremente y se reúnan en el gel de agarosa, formando así un complejo antígeno-anticuerpo. Debido a que el peso molecular de este complejo aumenta, se agrega y no continuará difundiéndose, formando una cinta o zona de precipitación lineal visible a simple vista. La banda de precipitación del complejo antígeno-anticuerpo es una barrera semipermeable específica que puede impedir el paso de moléculas de antígeno y anticuerpo con propiedades inmunológicas similares, pero permite que aquellas moléculas con propiedades diferentes sigan difundiéndose, de modo que las bandas de precipitación formadas por diferentes antígenos o la propia posición de los anticuerpos, permitiendo separar e identificar el sistema mixto.
El gel de agarosa se utiliza como medio de difusión porque hay una red porosa en el interior del gel de agarosa a una determinada concentración. Además, el tamaño de los poros es muy grande, lo que permite que las sustancias moleculares grandes (con pesos moleculares de cientos de miles a millones) pasen libremente. Como la mayoría de los antígenos y anticuerpos tienen pesos moleculares superiores a 200.000, pueden difundirse casi libremente en geles de agarosa.
Además, el gel de agarosa tiene las ventajas de buena estabilidad química, alto contenido de agua, buena transparencia, fuente conveniente y fácil manejo. Es el medio de difusión ideal en la tecnología de detección de inmunoprecipitación.
En experimentos de difusión de agar bidireccional, también se utiliza agar o agarosa como medio de difusión por las mismas razones mencionadas anteriormente.
⑵El papel de la agarosa en la síntesis de sondas de ADN bicatenario.
Los métodos de síntesis de sondas de ADN de doble cadena incluyen principalmente el método de traducción de mellas y el método de síntesis de cebadores aleatorios.
Método de traducción de huecos
Hay varios factores que afectan la reacción de traducción de mella: (a) La actividad específica del producto depende de la actividad específica de [α-32 P]dNTP y los nucleósidos en la plantilla Grado de sustitución del ácido. (La cantidad de ADNasa I y la calidad de la ADN polimerasa de E. coli afectarán el tamaño del fragmento del producto. (c) Inhibidores como la agarosa en la plantilla de ADN inhibirán la actividad de la enzima, por lo que se debe utilizar ADN cuidadosamente purificado. .
Método de síntesis de cebadores aleatorios
El método de síntesis de cebadores aleatorios también se puede realizar directamente en agarosa de bajo punto de fusión
Las anteriores son algunas de las aplicaciones del gel de agarosa en diversos campos de la biología Sin embargo, debido al rápido desarrollo de la investigación biológica, la aplicación del gel de agarosa puede ser más amplia y desempeñará el papel que le corresponde en la investigación biológica.
Ejemplos de desarrollo: agar. y agarosa Debido a sus propiedades especiales de gel, especialmente su notable estabilidad, histéresis e histéresis, tiene un efecto estabilizador especial y es fácil de absorber agua, ha sido ampliamente utilizado en alimentos, medicinas, industria química, textiles, defensa nacional y. En otros campos, según las estadísticas, existen más de 1.000 usos del agar y la agarosa, y son conocidos internacionalmente como "Nuevos productos del este de Asia". En la industria alimentaria, se pueden utilizar para producir: gomitas de cristal, gomitas de formas especiales. , productos acuáticos, conservas de carne y bebidas de frutas, bebidas de pulpa de frutas, bebidas de vino de arroz, bebidas lácteas, productos boutique, natillas.