Experimento de aprender ahora y vender ahora - Transformación de hongos con Agrobacterium
Introducción
Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT) Se ha utilizado en experimentos de transformación de células vegetales. Este artículo utiliza Fusarium oxysporum como ejemplo para construir cuatro sistemas de vector dual y optimizarlos. las condiciones experimentales para que ATMT manipule genes de hongos y construya mutantes de inserción. Los experimentos han encontrado que la eficiencia de la transformación se ve afectada más significativamente por la cantidad de esporas de hongos y Agrobacterium durante el período de cultivo.
Materiales y métodos
Materiales fúngicos
F. oxysporum cepa O-685, irradiado con lámparas fluorescentes durante 12 días consecutivos a 22°C, y utilizando CLA medio (medio de agar agua de hoja de clavel, las hojas de clavel se secan, se esterilizan y se rocían sobre agar agua (también se puede usar medio CMC o frijol mungo) para inducir la producción de conidias fúngicas. Enjuague la superficie de la colonia cultivada con agua esterilizada y recójala con una pipeta, y use una tela filtrante Miracloth (Calbiochem Behring, La Jolla, CA) para filtrar el micelio más grande y obtener una suspensión de esporas (1 × 106? conidios por ml).
Construcción de vectores
Todos los vectores se construyeron basándose en el vector pCAMBIA1300 (CAMBIA, Canberra, Australia). (Los resultados muestran que tanto el vector básico como el modificado pueden funcionar en Fusarium oxysporum. El vector utilizado en este artículo es mucho más pequeño que el pUR5750 utilizado en estudios anteriores, 14kb)
(1) pBHt1 ( 8,4 kb) Vector: El plásmido pCSN44 se digirió con BamHI y HindIII para obtener un inserto de 1,4 kb que porta el gen de resistencia a higromicina B (hph) y el promotor trpC de Aspergillus nidulans. El vector pCAMBIA1300 básico es como lo muestra la flecha en la figura. Esta parte se corta con las enzimas XhoI y BstXI, y el fragmento de inserción anterior se liga para obtener finalmente el vector pBHt1 (8,4 kb).
(2) Vector pDHt (7,1 kb): después de que las dos enzimas de (1) actúan sobre el vector básico, los fragmentos obtenidos se autoligan sin insertar fragmentos.
(3) Vector pBHt2 (8,4kb): similar a (1), pero la secuencia de inserción se obtiene del plásmido pCB1004.
(4) Vector pKHt (10,6kb): El fragmento de 2,2kb contiene los genes de origen de replicación ColE1 (replicación de origen) y de resistencia al cloranfenicol (ferringcloranfenicol resistencia). Esta secuencia se obtuvo amplificando pBCSK (Stratagene, La Jolla, CA) con cebadores específicos ECO-1 y PST-1. Basado en pBHt2, la posición de inserción es MCS (el sitio de clonación múltiple, MCS incluye sitios EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI y HindIII).
Transformación
(1) Cepa de Agrobacterium tumefaciens ?AGL-1 que contiene un vector dual adecuado a 28 °C, MM que contiene kanamicina (50 μg/ml) Medio de crecimiento (medio mínimo ( g/L): K2HP04, 2,05; KH2P04, 1,45; NaCI, 0,15; (NH4)2S04, 0,5) 2d.
(2) Se cultivaron células de Agrobacterium en medio IM (medio de inducción: sales MM, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) 40 mM, pH 5,3, glucosa 10 mM, 0,5% (p/p). v) Diluir hasta OD600= 0,15 en 200 µM AS) y continuar cultivando durante 6 horas. (Los resultados muestran que AS no es necesario durante el precultivo)
(3) Luego mezcle el líquido de bacterias Agrobacterium y la suspensión de esporas preparada anteriormente en una proporción de 1:1. Se esparcieron 200 µl de la solución mixta sobre el papel de filtro de celulosa digerida (filtro de nitrocelulosa) y el papel de filtro se colocó sobre la placa de cultivo ***. La única diferencia entre el medio utilizado y el IM fue que el contenido de glucosa fue de 10 mM. . Incubar a 25°C durante 2 días.
(4) Transfiera el papel de filtro a medio MM que contenga higromicinaB (75 µg/ml), cefotaxima (200 µM) y moxalactum (100 µg/ml).
(5) Los transformantes fúngicos obtenidos se transfirieron de forma independiente a una placa de 24 pocillos que contenía CLA e higromicina B (75 µg/ml) y se cultivaron hasta que se produjo la esporulación.
(6) Las esporas producidas por transformantes independientes se diluyeron en agua y se esparcieron sobre PDA que contenía higromicina B (75 µg/ml). Se obtuvieron colonias de una sola espora. Y a través de múltiples generaciones de cultivo sin antibióticos, seguidas de una reinoculación en un medio que contenía antibióticos, se probó la estabilidad de la transformación (el artículo mostró que el gen todavía era genéticamente estable después de 6 generaciones).
Transformación de Coniothyrium minitans, un parásito de Sclerotinia sclerotiorum, con Agrobacterium tumefaciens (Li et al., 2005) Transformación mediada por Agrobacterium de Scutellaria sclerotiorum en Sclerotinia sclerotiorum
Este artículo también utiliza transformación de Agrobacterium, pero debido a que los hongos experimentales son diferentes, este artículo se basa en el artículo anterior y cambia la temperatura y el tiempo del cultivo de hongos; concentración de esporas de hongos (107?esporas/ml y Agrobacterium*** La concentración de AS durante el cultivo); fue de 400 µM. y una gama de concentraciones de antibióticos que varían según el material.
Referencias
Li, M., Gong, X., Zheng, J., Jiang, D., Fu, Y. y Hou, M. (2005) Transformación de Coniothyrium minitans, un parásito de Sclerotinia sclerotiorum, con Agrobacterium tumefaciens. Cartas de microbiología FEMS 243: 323-329.
Mullins, E.D., Chen, X., Romaine, P., Raina, R. Geiser, D.M. y Kang, S. (2001) Transformación de Fusarium oxysporum mediada por Agrobacterium: una herramienta eficaz para la mutagénesis por inserción y la transferencia de genes 91: 173-180.