¿Cuáles son los pasos específicos para la electroforesis en gel de agarosa? ¿A qué debo prestar atención?

1. Método de electroforesis

Generalmente, la detección de ácido nucleico solo requiere electroforesis en gel de agarosa si se requiere electroforesis de alta resolución, especialmente si la diferencia es solo unas pocas; pb En este caso, se debe elegir la electroforesis en gel de poliacrilamida; la electroforesis en gel pulsada debe usarse para cadenas de ADN enormes que no son adecuadas para la electroforesis ordinaria.

2. Concentración del gel

Para la electroforesis en gel de agarosa, la concentración suele estar entre 0,5 ~ 2 %. Se utilizan concentraciones bajas para la electroforesis de fragmentos grandes de ácido nucleico y se utilizan concentraciones altas. para electroforesis de grandes fragmentos de ácido nucleico. Análisis de fragmentos pequeños. Los geles de baja concentración son quebradizos, por lo que la solución es un manejo cuidadoso y agarosa de buena calidad.

3. Solución tampón

Los tampones utilizados habitualmente incluyen TAE y TBE. Tiene mejor capacidad de amortiguación que TAE. El uso de un tampón recién preparado puede mejorar significativamente el efecto de la electroforesis.

4. Voltaje y temperatura

Durante la electroforesis, la intensidad del campo eléctrico no debe exceder los 20 V/cm y la temperatura de la electroforesis debe ser inferior a 30 °C. Para la electroforesis de ADN gigante, la temperatura debe ser inferior a 65438 ± 05 ℃.

5. Pureza y estado de las muestras de ADN

Cabe señalar que un contenido excesivo de sal en la muestra y proteínas que contengan impurezas producirán bandas borrosas y faltantes. La precipitación con etanol elimina el exceso de sal y el fenol elimina las proteínas.

6.Muestreo de ADN

La carga correcta de ADN es garantía de bandas claras. Tenga en cuenta que demasiada carga de ADN puede dar lugar a patrones de bandas de ADN ambiguos, mientras que una carga muy pequeña de ADN puede dar lugar a señales de banda débiles o incluso faltantes.

7. Selección de marcadores

La electroforesis de ADN debe utilizar marcadores de ADN de tamaño conocido o ADN de control positivo para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN. Los marcadores deben seleccionarse con pasos densos cerca del tamaño del fragmento objetivo para estimar con mayor precisión el tamaño del fragmento objetivo.

8. Tinción y observación en gel

El bromuro de etidio (EB) es un tinte de ácido nucleico comúnmente utilizado en laboratorios. Tiene un buen efecto de tinción y es fácil de operar, pero tiene poca estabilidad. . toxicidad. Al observar geles, se debe tener cuidado de utilizar la fuente de luz y la longitud de onda de excitación adecuadas para los diferentes tintes. Si la longitud de onda de excitación es incorrecta, la banda no se observará fácilmente y aparecerá borrosa.

2. Notas:

1. Es posible que la enorme cadena de ADN no pueda salir del orificio del gel mediante electroforesis ordinaria, lo que provoca que falten bandas.

2. La alta concentración de pegamento puede dificultar la distinción de bandas de ADN con tamaños moleculares similares, lo que provoca que falten bandas.

3. Después de utilizar el tampón de electroforesis varias veces, la fuerza iónica disminuye, el valor del pH aumenta y el rendimiento del tampón disminuye, lo que puede provocar bandas borrosas y migración irregular de bandas de ADN en la electroforesis de ADN.

4. Si el voltaje y la temperatura durante la electroforesis son demasiado altos, las bandas pueden verse borrosas y las bandas de ADN pueden migrar de forma irregular. Especialmente si el voltaje es demasiado alto, puede provocar que pequeños fragmentos se escapen del pegamento y provoquen fugas de cinta.

5. Las muestras de ADN desnaturalizadas pueden causar bandas borrosas y faltantes, y también puede ocurrir una migración irregular de las bandas de ADN. No caliente las muestras de ADN antes de cargarlas. La dilución con tampón NaCl 20 mM previene la desnaturalización del ADN.

6. Demasiada carga de ADN puede dar lugar a patrones de bandas de ADN ambiguos, mientras que muy poca carga de ADN puede dar lugar a señales de banda débiles o incluso faltantes.

Datos ampliados

El gel de agarosa tiene una estructura de red, y las moléculas de sustancias encontrarán resistencia cuando pasen, y las moléculas grandes encontrarán una gran resistencia cuando surjan. Por tanto, en la electroforesis en gel, la separación de partículas cargadas depende no sólo de la naturaleza y cantidad de la carga neta, sino también del tamaño de las moléculas, mejorando enormemente la resolución.

Sin embargo, debido a que el tamaño de sus poros es demasiado grande en comparación con las proteínas, su efecto de tamiz molecular es insignificante para la mayoría de las proteínas y actualmente se usa ampliamente en la investigación de ácidos nucleicos.

Las proteínas y los ácidos nucleicos llevan diferentes cargas según diferentes valores de pH, y experimentarán diferentes fuerzas en el campo eléctrico, por lo que correrán a diferentes velocidades. Según este principio, se pueden separar. El valor de pH del tampón de electroforesis está entre 6 y 9 y la fuerza iónica óptima está entre 0,02 y 0,05. La agarosa al 1% se utiliza habitualmente como soporte de electroforesis.

El gel de agarosa puede distinguir fragmentos de ADN que difieren en aproximadamente 100 pb. Aunque su resolución es menor que la del gel de poliacrilamida, es fácil de preparar y tiene un amplio rango de separación.

El rango de ADN separado por gel de agarosa común es de 0,2 a 20 kb, y la electroforesis por pulsos puede separar fragmentos de ADN de hasta 10 7 pb.

Las moléculas de ADN tienen efectos de carga y efectos de tamiz molecular al nadar en gel de agarosa. Las moléculas de ADN están cargadas negativamente en soluciones de pH por encima del punto isoeléctrico y se mueven hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico. Debido a la estructura repetitiva de la columna vertebral de azúcar-fosfato, la carga neta del mismo número de ADN bicatenario es casi la misma, por lo que pueden moverse hacia el polo positivo a la misma velocidad.

Enciclopedia Baidu-Electroforesis en gel de agarosa