¿Cuál es el principio de la electroforesis en gel de agarosa?
Las moléculas de ADN están cargadas negativamente en soluciones por encima de su punto isoeléctrico y se mueven hacia el ánodo en un campo eléctrico. Bajo una determinada intensidad de campo eléctrico, la velocidad de migración de las moléculas de ADN depende del efecto de tamiz molecular, es decir, el tamaño y la configuración de la propia molécula son los principales factores que influyen. La velocidad de migración de las moléculas de ADN es inversamente proporcional a su peso molecular relativo.
Las moléculas de ADN con diferentes configuraciones migran a diferentes velocidades. Por ejemplo, una muestra de molécula de ADN circular tiene tres configuraciones moleculares: molécula superenrollada de círculo cerrado (cccDNA), molécula de ADN de círculo abierto (ocDNA) y molécula de ADN lineal (IDNA). El orden de velocidad de migración de estas tres moléculas con diferentes configuraciones durante la electroforesis es CCCNA > IDNA > OCDNA.
Las moléculas de ácido nucleico son moléculas de disociación anfipática. El pH 3,5 es la disociación del grupo amino en la base. Sólo uno de los tres grupos fosfato se disocia, por lo que la molécula queda cargada positivamente y nada hacia el electrodo negativo. en el campo eléctrico. Entonces qué. A un pH de 8,0 a 8,3, las bases son casi inseparables y los grupos fosfato están libres, por lo que las moléculas de ácido nucleico están cargadas negativamente y nadan hacia el electrodo positivo en el campo eléctrico.
La densidad de carga de diferentes moléculas de ácido nucleico es casi la misma, por lo que tiene poco efecto sobre la velocidad de nado. Cuando es neutro o alcalino, la movilidad del ADN monocatenario es casi la misma que la del ADN bicatenario de la misma longitud.
Datos ampliados
Factores que afectan a la movilidad de las moléculas de ácido nucleico
1 Propiedades físicas de la muestra
Es decir, el tamaño. y carga de la molécula, forma de las partículas y configuración espacial. En términos generales, cuanto mayor es la densidad de carga, mayor es la tasa de nado. La densidad de carga de diferentes moléculas de ácido nucleico es casi la misma, por lo que el impacto en la movilidad no es evidente.
Para las moléculas lineales, el logaritmo común del peso molecular es inversamente proporcional a la velocidad de nado. Utilice esta muestra estándar para realizar electroforesis y medir su velocidad de natación, y luego utilice el logaritmo negativo de la longitud de la molécula de ADN (BP)-distancia de natación como curva estándar, que se puede utilizar para determinar la longitud de moléculas desconocidas.
La configuración espacial de las moléculas de ADN tiene un gran impacto en la movilidad, al igual que las moléculas de plásmidos. El orden de movilidad es cDNA > cDNA > IDNA > ocDNA. Sin embargo, ocurre la situación opuesta debido a la influencia de la concentración de agarosa, la intensidad del campo eléctrico, la fuerza iónica y el bromuro de etidio.
2. Medio de soporte
La electroforesis de ácidos nucleicos suele utilizar gel de agarosa y gel de poliacrilamida. La agarosa es una molécula lineal con cadenas poliméricas. Los tamices moleculares compuestos de geles que contienen diferentes concentraciones de agarosa tienen diferentes tamaños de poros y se utilizan para separar moléculas de ácido nucleico en diferentes rangos de concentración. El gel de poliacrilamida se polimeriza mediante acrilamida (Acr) bajo la catálisis de N,N,N'-tetrametiltetraetilentetramina (TEMED) y persulfato de amonio (AP) entrecruzado. El tamaño de la malla está determinado por la relación relativa de Acr y Bis.
El gel de agarosa es adecuado para separar moléculas con una longitud de 100 a 60, y el gel de poliacrilamida es mejor para separar fragmentos pequeños (5 pb-500 pb). Elija geles de diferentes concentraciones para separar moléculas de ADN de diferentes tamaños.
3. Intensidad del campo eléctrico
Cuanto mayor es la intensidad del campo eléctrico, más rápido nadan algunas partículas. El rango de separación efectivo del gel disminuye a medida que aumenta el voltaje, por lo que la electroforesis generalmente utiliza un voltaje bajo, no más de 4 V/cm. Para la electroforesis de fragmentos grandes, incluso utilizamos 0,5-1,0 V/cm para la electroforesis nocturna. Para la electroforesis de alto voltaje sólo se pueden utilizar geles de poliacrilamida.
4. Fuerza iónica de la solución tampón
¿TAE? Sistemas de amortiguación TBE y TPE, pero cada uno tiene sus ventajas y desventajas. TAE es barato pero tiene una baja capacidad de amortiguación y requiere una amortiguación bipolar cíclica. Cuando el TPE recupera el ADN, contaminará el fosfato y afectará las reacciones posteriores. Por lo tanto, a menudo se utilizan buffers.
Añadir EDTA al tampón puede quelar iones divalentes, inhibir la ADNasa y proteger el ADN.
El valor del pH del tampón suele ser alcalino o neutro. En este momento, las moléculas de ácido nucleico están cargadas negativamente y se mueven hacia el electrodo positivo.
El tinte comúnmente utilizado para la electroforesis de ácidos nucleicos es el bromuro de etidio (¿bromuro de etidio? EB). El bromuro de etidio es una molécula plana que se puede incrustar entre pares de bases en ácidos nucleicos bicatenarios. Cuando el complejo BE-DNA se irradia con luz ultravioleta, se producen diferentes efectos.
Cuando se irradia con luz ultravioleta de 254 nm, la sensibilidad es la más alta, pero el daño al ADN es grave cuando se usa irradiación ultravioleta de 360 nm, la sensibilidad es menor, pero el daño al ADN es menor y es; Adecuado para la observación y recuperación de muestras de ADN. La irradiación ultravioleta de 300 nm tiene una alta sensibilidad y no causa mucho daño al ADN, por lo que también es adecuada.
Para teñir muestras de ADN con bromuro de etidio, añadir EB a una concentración final de 0,5μg/ml al gel. Cuando la EB se mezcla con moléculas de ADN, la migración de ácidos nucleicos se puede observar en cualquier momento durante la electroforesis. Sin embargo, si desea determinar el tamaño de las moléculas de ácido nucleico, no se debe utilizar el método anterior, sino que se debe remojar el gel en una solución que contenga 0,5 μg/ml de EB durante 10 a 30 minutos después de la electroforesis. BE se descompondrá con la luz y debe almacenarse a 4°C protegido de la luz.
Materiales de referencia:
Enciclopedia Baidu - Electroforesis en gel de agarosa
Materiales de referencia:
Enciclopedia Baidu - Electroforesis en gel
p >