El papel de la tecnología de electroforesis en la ingeniería de bioseparación
En 1937, el profesor Arne Tiselius, ganador del Premio Nobel, utilizó algunos fenómenos electroforéticos para inventar la primera electroforesis de interfaz para el estudio de la separación de proteínas, marcando el comienzo de una nueva era en la tecnología de electroforesis.
Desde entonces, han surgido varias tecnologías e instrumentos de electroforesis uno tras otro. El desarrollo continuo de instrumentos de electroforesis avanzados y tecnología de electroforesis les ha otorgado una posición importante en la tecnología experimental bioquímica. Según el principio de la electroforesis, existen tres formas de sistemas de separación electroforética: en principio, se dividen según el principio de la electroforesis, a saber, electroforesis de interfaz móvil, electroforesis de zona y electroforesis en estado estacionario o electroforesis de desplazamiento (desplazamiento).
La electroforesis de interfaces de movimiento libre, que mide la velocidad de movimiento de moléculas cargadas observando el movimiento de la interfaz, se ha convertido en una cosa del pasado.
En su lugar, utilice electroforesis zonal con un medio de soporte.
El valor de aplicación clínica de la electroforesis zonal varía dependiendo del tipo de soporte, tamaño de partícula y método de electroforesis.
Los medios de soporte de fase sólida se pueden dividir en dos categorías: uno es papel de filtro, membrana de acetato de celulosa, gel de sílice, alúmina, celulosa, etc.; el otro es gel de almidón, agarosa y poliacrilamida.
Debido a su estructura de red porosa fina, no solo puede producir electroforesis, sino que también tiene un efecto de tamiz molecular. Las moléculas pequeñas correrán más rápido que las moléculas grandes, mejorando la resolución.
Su mayor ventaja es que apenas adsorbe proteínas, por lo que no habrá colas en la electroforesis.
La electroforesis en agarosa de baja concentración es equivalente a la electroforesis de interfaz libre. La proteína puede penetrar libremente en el campo eléctrico, con pequeña fuerza negativa, separación clara, alta transparencia y puede penetrar la sensibilidad de detección de la banda ** con una longitud de onda de 200 ~ 7000 nm. Por tanto, el primer tipo de soporte ha sido sustituido por el segundo tipo.
La característica de la electroforesis estable o electroforesis por desplazamiento es que la migración electroforética de partículas moleculares alcanza un estado estable después de un cierto período de tiempo, como por ejemplo isoelectroenfoque, isotacoforesis, etc.
La electroforesis de zona es la tecnología más utilizada en el campo de las pruebas clínicas y tiene una importancia clínica importante, especialmente la aparición de otras nuevas tecnologías ha ampliado su alcance de aplicación y ha mejorado la tecnología de detección. Este artículo revisa el estado actual y el desarrollo de esta tecnología.
1. La interpretación correcta de los resultados de la electroforesis es útil para el juicio clínico de la enfermedad.
El suero fresco puede describir con precisión la imagen general de las proteínas después de la electroforesis. Normalmente, la albúmina disminuye y las áreas de globulina aumentan, lo que sugiere implicaciones clínicas diferentes.
Por ejemplo, en la inflamación aguda se puede observar un aumento en los porcentajes de área de a1 y a2; en el síndrome nefrótico y en la glomerulonefritis crónica, la albúmina disminuye, la globulina a2 aumenta y la β-globulina también aumenta. En la anemia por deficiencia de hierro, la banda β puede aumentar debido a un aumento de la transferrina, mientras que en la enfermedad hepática crónica o cirrosis, la albúmina se reduce significativamente y la R-globulina aumenta de 2 a 3 veces, lo que indica un aumento de la inmunoglobulina policlonal, e incluso β. - fenómeno de puente de fusión, la región R puede mostrar bandas oligoclonales delgadas y densas; la electroforesis de proteínas séricas es el método preferido para detectar la proteína inmunoglobulina M con actividad uniforme sin anticuerpos producida por la proliferación anormal de células plasmáticas monoclonales.
Puede presentar una banda de proliferación de clones de proteínas de alta concentración, densa, profundamente teñida y en la zona a2-r del área de electroforesis, denominada banda de proteína M. Después del escaneo se forma un pico individual alto y estrecho. Si algunos picos están en la región R, la relación entre la altura del pico y el ancho de la base del pico es >2:1, pero debido a las limitaciones de la síntesis normal de inmunoglobulinas, la tinción de fondo será más clara.
Mieloma múltiple, macroglobulinemia, enfermedad de cadenas pesadas, enfermedad de cadenas ligeras libres, enfermedad semimolecular, gammaglobulinemia monoclonal benigna, proteinemia doble M, etc. Las enfermedades causadas por proteínas no son infrecuentes en la actualidad.
La electroforesis de proteínas séricas es de gran importancia para el diagnóstico precoz, la observación de la eficacia y el juicio pronóstico de este tipo de enfermedades.
En segundo lugar, la combinación de tecnología de electroforesis y tecnología de inmunología ha ampliado enormemente su alcance de aplicación clínica.
Permite que la corriente acelere la difusión de antígenos y anticuerpos y especifique su dirección de viaje, acelerando así la reacción de precipitación.
Existen muchas semillas de la tecnología de inmunoelectroforesis, como la inmunoelectroforesis convectiva (CIEP), la inmunoelectroforesis en cohete (RIE) y la electroinmunodifusión (EID).
A partir de estos métodos de inmunoelectroforesis, constantemente se derivan nuevas tecnologías, como la inmunoelectroforesis (IEP).
En 1969, Alper y Johnson recomendaron la electroforesis por inmunofijación (IFE), una técnica híbrida de electroforesis en gel de agarosa e inmunoprecipitación. La muestra a analizar puede ser suero, orina, líquido cefalorraquídeo u otros fluidos corporales.
En 1976, se volvió a recomendar la electroforesis por inmunofijación sérica (IF) para la tipificación de la proteína M.
Después de la separación de las proteínas séricas mediante electroforesis en medio de gel de agarosa, se aplican fijadores, diversas inmunoglobulinas y antisueros de cadena ligera a las calles de la superficie del gel. Después de la incubación, el fijador y el antisuero penetran y difunden en el gel, formando un complejo antígeno-anticuerpo en el lugar si el antígeno correspondiente está presente.
Después de la tinción, el carril de referencia de la electroforesis de proteínas y la zona de precipitación de antígeno-anticuerpo se tiñen con negro amino, y los componentes monoclonales se separan de acuerdo con la distancia del movimiento electroforético, de modo que varias inmunoglobulinas y sus cadenas ligeras puedan ser tipo separado.
Las mayores ventajas de esta tecnología son la sensibilidad de 50-150 mg/dl, ciclo operativo corto, alta resolución y fácil análisis de resultados.
En la actualidad, se utiliza con mayor frecuencia para la tipificación e identificación de la proteína M y se ha incluido en las pruebas de rutina en los laboratorios clínicos.
En tercer lugar, utilice la tecnología de electroforesis para analizar los perfiles de isoenzimas y mejorar la tasa de diagnóstico.
1. Isoenzima lactato deshidrogenasa sérica (iso-LDH): Los métodos para medir la isoenzima LDH incluyen electroforesis, cromatografía en columna de intercambio iónico, inmunoensayo, método inhibidor y método de digestión enzimática, pero la electroforesis en gel de agarosa sigue siendo, con diferencia, el método más utilizado. método más utilizado.
Después de la separación por electroforesis, se deben separar 5 bandas de isoenzimas. La LDH 1 promedio comienza a aumentar 6 horas después del inicio del infarto agudo de bíceps, y LDH1/LDH2 ≥ 1 es un nivel decisivo positivo para lesión miocárdica. La LDH5 estaba significativamente elevada en el cáncer de hígado y se midió el contenido de cada banda. El espectro de isoenzimas separado por electroforesis se escanea y cuantifica, y su precisión es significativamente mayor que la que se puede juzgar a simple vista.
2. Isoenzima creatina quinasa (CK) sérica; la determinación de CK y CH-MB todavía se utiliza para confirmar el infarto agudo de miocardio.
En los últimos años, algunas unidades domésticas han utilizado métodos de inmunosupresión para determinar CK=MB. El principio es resistir la actividad enzimática de la subunidad M. Debido a que casi no hay CK=BB en el suero normal, se puede considerar que este valor multiplicado por 2 representa aproximadamente la actividad de CK-MB.
Este método es sencillo y rápido, pero su desventaja es la poca especificidad. Si hay una anomalía de CK-BB o CK en el suero del paciente, se producirá un aumento falso.
Muchos autores han informado de isoenzimas CD anormales, una de las cuales se llama macro-CK (Maxro-major), que es un complejo de CK-BB e inmunoglobulinas, incluidas IgG e IgA, que es normal. La marco-CK solo representa del 0,8% al 1,6% en el suero. El otro tipo se llama CK mitocondrial (CK-MT), que se combina con músculos, cerebro y cerebro. La CK-MT no aparece en suero normal ni en el infarto de miocardio. Sólo se puede detectar en suero en casos de daño tisular extremo y daño extremo a las mitocondrias y las paredes celulares.
La CK gigante y la CK-MT atípica no pueden ser inhibidas por los anticuerpos M, por lo que cuando aparecen dan como resultado un falso aumento de la actividad de CK-MB por encima de la actividad de CK total.
La separación electroforética de CK-MB se basa en las diferentes estructuras moleculares de las CK-isoenzimas, que son recogidas y compiladas por la Red de Educación Médica en tampón de electroforesis y llevan diferentes cargas. Se pueden separar diferentes componentes de CK del cátodo al ánodo, que son CK-MM, CK-MB y CK-BB. La característica de la electroforesis es que cuando aparecen dos isoenzimas anormales, como la CK ⅰ gigante y la CK ⅱ gigante, se pueden encontrar fácilmente a partir del patrón de electroforesis y cada enzima se puede detectar con un escáner.
El CK macroscópico está entre CK mm y CK mm, y la montaña de CK está cerca del cátodo, detrás del CK mm.
De esta forma, CK-BB y varios Las isoenzimas anormales no se confundirán con CK-MB ni se diagnosticarán erróneamente, y la causa del falso aumento de CK-MB se resolverá fácilmente.
Por lo tanto, la electroforesis de isoenzimas CK es una tecnología de detección muy práctica y tiene una importancia clínica muy importante.
3. Isoenzimas de los subtipos de CK: Además, la electroforesis por enfoque isoeléctrico en gel de agarosa o la electroforesis de alto voltaje se utilizan a menudo para determinar los subtipos de CK-MB y CK-MM. Dado que la operación es más problemática que la electroforesis ordinaria, no se puede promover la determinación de rutina.
Actualmente, los instrumentos de electroforesis totalmente automáticos importados están equipados con kits de prueba que se pueden utilizar para el análisis del subtipo de CK.
El valor de referencia es CK-mm 1 (57,7 ± 4,7) %; CK-MM2 es (26,5 ± 5,3) es (15,8 ± 2,5) %; (rango (0,15-0,39), el nivel de decisión positiva es >:0,5. MM3 es dominante el primer día, mientras que MM1 es dominante después del segundo día.
La CKMB se separa mediante electroforesis. CKMB1 y CKMB2 son tan pequeños en la sangre normal que sus proporciones son casi engañosas. Después de un infarto agudo de miocardio, se pueden detectar isoformas 4-6hCKMB2 en la circulación sanguínea, por lo que la relación MB2/MB1 aumenta significativamente, antes que el fragmento total de CK-MB.
Cuando se alivie el infarto de miocardio, este ratio irá disminuyendo paulatinamente.
También se puede utilizar para observar la situación tras el tratamiento trombolítico.
En cuarto lugar, combinar la tecnología de anticuerpos inmunomarcadores enzimáticos para detectar bandas oligoclonales en el líquido cefalorraquídeo.
Se informa que la electroforesis bidimensional y la tinción con plata son métodos comunes para aislar e identificar proteínas del líquido cefalorraquídeo. Este método es complejo y requiere mucho tiempo. Ahora, las proteínas del líquido cefalorraquídeo se separan mediante electroforesis en gel de agarosa de alta resolución y el "OCB" se identifica mediante la reacción del antígeno con anticuerpos IgG específicos marcados con peroxidasa de rábano picante. Después de la tecnología de amplificación de inmunomarcaje enzimático y los pasos de desarrollo del color, la proteína se puede detectar cuando la concentración alcanza 31-125 ul/L, lo que puede aumentar la sensibilidad de detección 100 veces, eliminando la necesidad de concentrar el líquido cefalorraquídeo y evitando la pérdida de proteína durante El proceso de concentración.
Puede utilizarse para confirmar y diferenciar las inmunoglobulinas OCB y sus tipos.
Si se detecta OCB en la muestra de líquido cefalorraquídeo, pero no se detecta ninguna banda en la muestra correspondiente, es positivo, lo que refleja fielmente la inmunoglobulina sintetizada por el propio sistema nervioso central y tiene un importante significado clínico.
Esta es una prueba cualitativa, y el OCB es un signo muy importante de esclerosis múltiple.
Sin embargo, se deben analizar simultáneamente el suero y el líquido cefalorraquídeo del paciente el mismo día para identificar inmunoglobulinas de diferente origen.
La inmunoglobulina sintetizada centralmente es una señal importante para las enfermedades del sistema nervioso central y se utiliza principalmente para la identificación de enfermedades del sistema nervioso central como la esclerosis múltiple, la demencia, la mielitis, la encefalitis paraneoplásica y el diagnóstico de neuromesinosis.
5. Separar la lipoproteína (A) mediante reacción antígeno-anticuerpo en fase sólida y utilizarla para detectar factores de riesgo independientes para el corazón y el cerebro.
Esta tecnología identifica lipoproteínas separadas por electroforesis mediante reacciones antígeno-anticuerpo.
Después de la electroforesis en gel de agarosa y la tinción, pueden aparecer diferentes bandas de lipoproteínas en el suero.
Debido a los diferentes puntos isoeléctricos de las lipoproteínas en el gel, no sólo se pueden distinguir las bandas A, pre-β y β, sino que también hay anticuerpos anti-LP(a) y cationes en la medio, y anti-LP(a) y LP(a) de los pacientes en suero se combinan para formar un complejo, mientras que los cationes inhiben la velocidad de natación de otras lipoproteínas, lo que hace que LP(a) se separe de otras lipoproteínas, permitiendo que LP(A) tiene una resolución muy clara. Después de escanear las bandas positivas, se puede obtener el área y el porcentaje de las bandas. Este método hace que la tecnología de electroforesis sea más perfecta y reduce en gran medida las desventajas de las operaciones manuales. No solo se puede semicuantificar, sino que también se puede guardar la película para comparar.
Mejorar la sensibilidad y especificidad de la detección del factor de riesgo independiente LP(a) para enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares.
6. Realizar electroforesis de proteínas en orina no concentradas según el peso molecular para distinguir los tipos de proteínas en orina.
La electroforesis de proteínas en la orina puede separar varias proteínas de la orina para distinguir el tipo de proteína de la orina y puede ayudar a determinar la ubicación del daño renal sin necesidad de cirugía clínica.
Algunos laboratorios domésticos utilizan electroforesis en disco SDS-PAGE para separar las proteínas de la orina. Este método tiene grandes limitaciones, requiere mucho tiempo, operaciones complejas, altos requisitos de muestra y requiere preconcentración de orina, lo que lo hace inadecuado para laboratorios clínicos.
La electroforesis SDS=AGE no requiere preconcentración. La electroforesis de proteínas en orina muestra áreas proteicas de peso molecular medio y alto dominadas por lesiones glomerulares reactivas. Están presentes bandas de proteínas de bajo peso molecular, que se pueden observar en las lesiones tubulares renales y en la proteinuria por desbordamiento; en la proteinuria mixta se pueden observar bandas de peso molecular grande, mediano y pequeño, lo que indica que tanto los glomérulos como los túbulos renales están involucrados.
El escáner puede escanear el perfil de proteínas en la orina después de la electroforesis y averiguar el porcentaje, mostrando así el grado de daño tubular glomerular o renal. El perfil de electroforesis y la imagen escaneada se pueden utilizar permanentemente como datos nacionales. lo cual es beneficioso para analizar y comparar.
La mayor mejora de esta tecnología es que no es necesario preconcentrar la orina, la operación es simple, los resultados son claros, el experimento se puede completar en solo tres horas y hay resultados cualitativos completos. Los estándares, que son fáciles de cuantificar y analizar, y son de gran utilidad para el tratamiento de enfermedades renales. El diagnóstico, el diagnóstico diferencial, guiar el tratamiento y juzgar la curación son de gran valor.
La electroforesis capilar recientemente desarrollada es un nuevo tipo de electroforesis zonal, también llamada electroforesis capilar zonal.
Llene el capilar con solución tampón, inyecte la muestra en un extremo del capilar, aplique alta presión de CC en ambos extremos del capilar para separar la muestra y las muestras separadas serán detectadas por el detector instalado en un extremo del capilar.
La electroforesis capilar también se utiliza mucho en medicina de laboratorio. A juzgar por la fuente de las muestras de prueba, se pueden dividir en muestras de orina, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, glóbulos rojos, otros fluidos o tejidos corporales y animales de experimentación.
Desde la perspectiva de los objetos de separación, incluye proteínas, péptidos, aminoácidos, azúcares, enzimas, ADN, oligonucleótidos, virus, pequeñas moléculas biológicamente activas, iones, fármacos y sus metabolitos.
Se puede dividir en diagnóstico clínico de enfermedades, análisis clínico de proteínas, análisis clínico de fármacos, investigación metabólica, investigación patológica, análisis de isoenzimas, análisis de productos de PCR, análisis de secuencias y fragmentos de ADN, etc.
Debido a su incomparable eficiencia y rapidez, ha atraído la atención de cada vez más científicos.
La tecnología de electroforesis de mi país comenzó no demasiado tarde, pero debido a varias razones, la mayoría de los laboratorios todavía utilizan equipos de electroforesis relativamente atrasados.
Con el rápido desarrollo de la ciencia y la tecnología nacionales e internacionales y el rápido desarrollo de la medicina de laboratorio, la tecnología de electroforesis también se desarrolla y actualiza constantemente y tiene un valor de aplicación extremadamente amplio en los campos de la medicina clínica y la biología molecular. . Creo que a medida que esta tecnología continúe desarrollándose, se volverá cada vez más popular entre sus pares.