Pasos experimentales para determinar E. coli en agua
Métodos para probar coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli en alimentos para exportación
Número de serie 0169—92
Reemplazar zbx09 002-86.
1 Contenido temático y ámbito de aplicación
Esta norma especifica los métodos de prueba para coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli en alimentos exportados.
Esta norma se aplica a la inspección de alimentos exportados.
2 Equipos y Materiales
2.1 Pipeta: 1mL, con escala de 0,1ml; 5mL y 10mL, con escala de 1mL.
2·2 Baño María: 44,5±0,5℃.
2.3 Incubadora: 36 65438±0℃, 44,5±0,5℃.
2.4 Frigorífico: 0~5℃ y -15~-20℃.
2.5 Homogeneizador.
2.6 Mortero y varilla abrasiva.
Tablero 2.7: 90 mm de diámetro.
Balanza 2.8: sensibilidad 0,1g.
2.9 Microscopio.
2.10 Frascos de dilución: matraces Erlenmeyer de 100mL, 200mL y 500mL y frascos de boca ancha.
2.11 Cuentas de vidrio: diámetro de unos 5 mm.
2.12 Contador de colonias.
3 Medios de cultivo y reactivos
3.1 Caldo de lauril sulfato de tripsina (LST).
3.2 Caldo de sales biliares de lactosa de color verde brillante (BGLB).
Caldo 3.3 CE.
3.4 Agar Eosina Azul de Metileno (EMB).
Agar 3,5 nutritivo inclinado.
Caldo 3.6 triptófano.
3.7 MR-VP es medio.
3.8 Caldo de ácido cítrico de Coriolis.
3.9 Agar bilis rojo neutro violeta cristal (VRBA).
3.10 Diluyente tampón fosfato Butterfield.
3.11 Suero fisiológico.
3.12 Tinción de Gram.
3.13 Reactivo matriz de índigo de Kovacs.
3.14 Indicador rojo de metilo.
3.15 Reactivo de Vogels-Proskauer (v-p).
4 Preparación de la muestra
4.1 Tomar muestras representativas mediante operación aséptica. Si hay embalaje, limpie la abertura con etanol al 75% y tome una muestra. Si no es posible realizar una inspección oportuna, las muestras congeladas deben almacenarse a -65438 ± 05 °C; los alimentos no congelados y perecederos deben almacenarse en un refrigerador a 4 °C. Las muestras congeladas antes de la inspección se pueden descongelar en 65.438 ± 08 horas a 2-5°C, o en 65.438 ± 05 minutos a 45°C.
4.2 Preparación de soluciones homogéneas de diferentes muestras de alimentos
4.2.1 Alimento líquido
Tomar una muestra de 25mL con una pajita esterilizada y añadir 25ml de diluyente en un Frasco de vidrio estéril (la cantidad adecuada de perlas de vidrio está preestablecida en el frasco), agítelo 25 veces en 7 segundos con una amplitud de 30 cm (o agítelo con un oscilador mecánico) para preparar una solución de muestra homogénea 1:10.
4.2.2 Alimentos sólidos y semisólidos
Operación aséptica, tomar 25 g de muestra, colocarla en un vaso de homogeneización esterilizado que contenga 225 ml de diluyente y homogeneizar a 8000 r/min 1 a 2 minutos para hacer una muestra homogeneizada 1:10 (también puedes molerla en un mortero esterilizado).
4.3 Dilución del homogeneizado de muestra Según la estimación de la contaminación de la muestra, el homogeneizado de muestra se convierte en una serie de diluciones de muestra en incrementos de diez veces, como 10-2, 10-3 y 10-. 4. Todo el proceso, desde la preparación de la muestra hasta la dilución, no debería llevar más de 15 minutos.
5 Determinación de coliformes
5.1 Determinación del valor NMP de coliformes
5.1.1 Para cada muestra, seleccionar la dilución de muestra adecuada, diluir serialmente tres veces. Inocular tres tubos de caldo LST por dilución, con 1 ml en cada tubo.
5.65438±0.2 Incubar el tubo inoculado a 36±65438±0℃ durante 48±2h.
5.1.3 Observe la producción de gas en el tubo de ensayo: verifique si hay burbujas en el tubo invertido y registre la cantidad de tubos de caldo LST que producen gas dentro de 24 h y 48 h. Si todos los tubos de caldo LST no producen gas, se pueden informar como negativos para E. coli; si se produce gas, se realizarán más pruebas de confirmación.
5.2 Prueba de confirmación de coliformes
5.2.1 Trasplantar todos los tubos traqueoblásticos a tubos de caldo de sales lactobiles de color verde brillante (BGLB) con un diámetro de 3 mm.
5.2.2 Coloque el tubo de caldo BGLB y cultive a 36 ± 65438 ± 0 ℃ durante 48 ± 2 h.
5.2.3 Registrar el número de traqueógenos en todos los tubos de caldo BGLB.
5.2.4 Informe de resultados: Según el número de tráqueas producidas por el caldo BGLB, consultar la tabla de NMP (ver Apéndice B (Suplemento)) y reportar el valor de NMP de los coliformes por gramo (ml) de la muestra.
6 Determinación de coliformes fecales
6.1 Trasplantar todos los cultivos en tubos de caldo LST que produzcan gas en 48±2 h a un tubo con asa de inoculación de 3 mm de diámetro en tubos de caldo EC.
6.2 Todos los tubos de caldo EC inoculados se colocan en un baño de agua cubierto a 44,5 ± 0,5 ℃ en 30 minutos y se cultivan durante 24 ± 2 h. El nivel de agua en el baño de agua debe ser más alto que el nivel de agua en el caldo. Se deben utilizar como controles positivos y negativos E. coli que se sabe que producen gas a 44,5 °C y Enterobacter aerogenes u otros coliformes que no producen gas a 44,5 °C.
6.3 Registrar la producción de gas del tubo de caldo EC. La prueba de coliformes fecales traqueales fue positiva; la prueba de coliformes fecales traqueales no productiva fue negativa.
6.4 Informe de resultados: Según el número de tráqueas, consultar la tabla de NMP y reportar el valor de NMP de coliformes fecales por gramo (ml) de muestra.
Determinación de 7 E. coli
7.1 Continuar cultivando el tubo de caldo EC en 6.3 durante 24 horas, tomar el cultivo traqueal, sembrarlo en la placa EMB y cultivarlo a 36 1℃ 24 2h.
7.2 Comprobar si en la placa existen colonias típicas con el centro negro, brillante o mate.
7.3 Si hay colonias típicas, seleccione al menos 2 colonias típicas de cada placa; si no hay colonias típicas, seleccione al menos 2 colonias sospechosas de cada placa. Utilice una aguja de inoculación para tocar el centro de la colonia, trasplántela en un agar inclinado nutritivo y cultívela a 36°C durante 18 a 24 horas.
7.4 Transfiera el cultivo inclinado al siguiente medio para realizar pruebas bioquímicas.
7.4.1 Caldo triptófano: después de cultivar a 36 ± 65438 ± 0 °C durante 24 ± 2 horas, agregue 0,2 ~ 0,3 ml de reactivo de Kovach y la capa superior mostrará una reacción positiva de índigo rojo. matriz.
7.4.2 Medio Mr-VP; cultivo a 3665438 ± 0 ℃ durante 48 2 h. Asépticamente, transfiera el cultivo de 1 ml a 13 mm × 100 mm, agregue 0,6 ml de solución de etanol de iota-naftol al 5 %, 0,2 ml de solución de hidróxido de potasio al 40 % y una pequeña cantidad de cristales de creatina, agite el tubo de ensayo y deje se deja reposar durante 2 horas. Si es rojo, la prueba VP es positiva.
Incubar el cultivo restante de Mr-VP durante otras 48 horas y añadir 5 gotas de solución de rojo de metilo. Si el cultivo se vuelve rojo, la prueba de rojo de metilo es positiva y si el cultivo se vuelve amarillo, la prueba es negativa.
7.4.3 Caldo de ácido cítrico Kessel: cultivar a 36 ± 65438 ± 0 ℃ durante 96 h y registrar si hay crecimiento.
7.4.4 Caldo LST: Incubar a 30 ± 65438 ± 0 ℃ durante 48 ± 2 h y observar si se genera gas en el tubo de ensayo.
7.4.5 Tinción de Gram: Tome un cultivo inclinado en agar nutritivo de 18 h y realice una tinción de Gram. E. coli es gramnegativa.
7.4.6 La identificación bioquímica de E. coli y no-E. coli es la siguiente:
Identificación de matriz índigo MR VP citrato (tipo)
++- E. coli típica
-+-E. coli atípica
+++Tipo intermedio típico
-+-+Tipo intermedio atípico
-++Enterobacter aerogenes típico
++ ++Enterobacter aerogenes atípico
Si hay un tipo de reacción bioquímica distinta a la tabla anterior, el cultivo puede Si es impuro, se debe volver a dividir y analizar nuevamente si es necesario.
7.5 Informe de resultados: Escherichia coli es un bacilo Gram negativo que fermenta la lactosa para producir ácido y gas. La prueba IMViC es ++- o -+-. Luego verifique la tabla de MPN según la cantidad de tubos positivos en el caldo LST e informe el valor de MPN de E. coli por gramo (ml) de muestra.
Determinación de coliformes en medios sólidos
8.1 La preparación de la muestra es la misma que en el Capítulo 4.
8.2 Conteo
8.2.1 Seleccionar las tres diluciones consecutivas apropiadas de la solución de muestra e inocularlas en dos placas esterilizadas, cada dilución es de 1 ml. Se añadió otro ml de diluyente a la placa de Petri estéril como control en blanco.
8.2.2 Vierta 10 ~ 15 ml de agar bilis rojo neutro púrpura cristalino (VRBA) enfriado a 45 ± 0,5 °C en cada placa de Petri. Gire con cuidado la placa de Petri para mezclar bien el medio de cultivo y la solución de muestra.
8.2.3 Después de que el agar se haya solidificado, agregue 3 ~ 4 ml de VRBA para cubrir la superficie de la placa.
8.2.4 Voltear la placa y cultivarla a 36 L°C durante 18 ~ 24 horas.
8.2.5 Seleccionar una placa con un recuento de colonias de 30 a 150 y contar los coliformes típicos que aparecen en la placa. Las colonias bacterianas típicas son de color rojo púrpura con un anillo rojo de precipitación de sales biliares a su alrededor. Las colonias tienen un diámetro de 0,5 mm o más.
Confirmación
8.2.6.1 Elija 10 tipos diferentes de colonias típicas y sospechosas de la placa VRBA, trasplántelas a tubos de caldo BGLB y cultívelas a 36 ± 1 ℃ durante 24 h y 48h, observar la producción de gas.
8.2.6.2 Determinar si el tubo de caldo productor de gas es positivo para E. coli. La tinción de Gram debe realizarse en tubos positivos que forman una película bacteriana para excluir los bacilos Gram positivos.
Informe de Resultados
El porcentaje de tubos de ensayo que finalmente se confirma que son positivos (Aerobacilos, bacilos Gram negativos) se multiplica por el número de colonias en placa contadas en 8.2.5, y luego se multiplica por el factor de dilución, es decir, el número de coliformes por gramo (ml) de muestra.
Ejemplo: 10-4 muestra dilución 1mL, hay 100 colonias típicas y sospechosas en la placa VRBA, 10 de ellas se inoculan en tubos de caldo BGLB, y 6 tubos positivos se confirman, entonces la muestra es coliforme El número es:
100×6/10×104/g (ml) = 6,0×105/g (ml)
Adjunto a
Medio y Reactivos
(Suplemento)
A1 Caldo Lauril Sulfato de Tripsina (LST)
Tripsina o tripsina.
20 gramos
Cloruro de sodio 5,0 gramos
Lactosa 5,0 gramos
2,75 gramos hidrogenofosfato dipotásico (K2HPO4)
Dihidrogenofosfato de potasio (kh2p 04) 2,75 g
Lauril sulfato de sodio 0,1 g
Agua destilada 1000,0 ml
Disolver los componentes en agua destilada. Utilice un tubo de fermentación invertido y colóquelo en tubos de ensayo de 20 mm × 150 mm, cada tubo tiene 10 ml. Autoclave a 121°C durante 15 minutos. El valor de pH final fue ph 6,8 ± 0,2.
Caldo A2 de lactosa y sales biliares de color verde brillante (BGAB)
Peptona 10,0 g
Lactosa 10,0 g
Bilis bovina en polvo (bilis de res o bilis de buey) solución 200,0 ml
Solución acuosa verde brillante al 0,1% 13,3 ml
Agua destilada
Disolver peptona lactosa en 500 ml de agua destilada, agregar 200 ml Solución en polvo de bilis de buey (disolver 20,0 g de polvo de bilis de buey deshidratado en 200 ml de agua destilada, pH 7,0 ~ 7,5), diluir a 975 ml con agua destilada y ajustar el pH a 7,4. Luego agregue 13,3 ml de solución acuosa de color verde brillante al 0,1%, complete hasta 1000 ml con agua destilada, filtre con algodón y distribuya en tubos de ensayo de 20 mm × 150 mm (con un pequeño tubo de fermentación invertido), cada tubo es de 10 ml. Autoclave a 121°C durante 15 minutos. El valor de pH final fue 7,2 ± 0,1.
Caldo A3 EC
Proteína pancreática o queso pancreático
20,0g
Sal biliar nº 3 o sal biliar mixta 1,5g
Lactosa 5,0 g
Hidrogenofosfato de potasio 4,0 g
Dihidrogenofosfato de potasio (KH2P04) 1,5 g
Cloruro de sodio 5,0 g
1000,0 ml de agua destilada
Disolver los ingredientes anteriores en agua destilada y dividir en tubos de ensayo de 16 mm × 150 mm (con pequeños tubos de fermentación invertidos), 8 ml por tubo.
Autoclave a 121°C durante 15 minutos, pH final es 6,9 0,1.
Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) A4
Peptona 10,0 g
Lactosa 10,0 g
2,0 g hidrogenofosfato dipotásico (KH2P04)
Agar 15,0g
Eosina γ (soluble en agua) 0,4g o 20mL de solución acuosa al 2%.
Azul de metileno 0,065g o solución acuosa al 0,5% 13mL.
1000,0 ml de agua destilada
Hervir peptona, fosfato y agar en 1000 ml de agua destilada, y añadir agua hasta completar la cantidad original. Distribuir en matraces Erlenmeyer. 100 ml o 200 ml por botella, esterilizar en autoclave durante 15 minutos. El pH final fue ph 7,1 ± 0,2. Derretir el agar antes de usarlo. Añadir 5 ml de solución acuosa de lactosa al 20% esterilizada, 2 ml de solución acuosa de eosina gamma al 2% y 1,3 ml de solución acuosa de azul de metileno al 0,5% por cada 100 ml de agar. 50°C y verter en un plato medio.
Agar nutritivo A5 inclinado
Pasta de ternera 3,0 g
Peptona 5,0 g
Agar 15,0 g
Destilado agua 1000,0 ml
Añadir los ingredientes anteriores en agua destilada y hervir para disolver. Alícuotas de tubos de ensayo apropiados. Autoclave a 121°C durante 15 minutos. El valor de pH final fue 7,3 ± 0,1. Después de la esterilización, colóquelo en una pendiente para su uso posterior.
Caldo triptófano A6
10,0 g de triptona o triptona
1000,0 ml de agua destilada
Calentar y remover para hacer la peptona del páncreas o se disuelve triptona en agua destilada. Tubos de ensayo individuales de 5 ml cada uno. Autoclave a 121°C durante 15 minutos. El valor de pH final fue ph 6,9 ± 0,2.
A7 MR-VP Medio
Peptona
7,0g
Glucosa 5,0g
Hidrogenofosfato de potasio 5,0 g
1000,0 ml de agua destilada
Disolver cada componente en agua destilada, dividir en tubos de ensayo y esterilizar a 0°C durante 1215 minutos. El pH final es pH 6,9±0,2. .
Caldo de Ácido Cítrico de Kother A8
Hidrogenofosfato de sodio (NaNH4HPO4?6?14H2O)
Hidrogenofosfato de potasio (K2HPO4) 1,0g
p>Sulfato de magnesio (MgSO4?6?17H2O) 0,2g
Citrato de sodio (incluido 2h2o) 3,0g
Agua destilada 1000,0 ml
Colocar Disolver todo ingredientes en agua destilada, distribuir en tubos de ensayo y esterilizar en autoclave 10 ml a 0 °C durante 12 a 15 minutos por tubo. El valor de pH final fue ph 6,7 ± 0,2.
Agar Bilis Rojo Neutro Violeta Cristal A9 (VRBA)
Peptona 7,0 g
Extracto de levadura 3,0 g
Lactosa 10,0 gramos
Cloruro de sodio 5,0g
Sal biliar o sal biliar nº 3 1,5 g
Neutro 0,03 g
Violeta cristal 0,002 g
Agar 15 ~ 18g
Agua destilada 1000,0 ml
Disolver los componentes anteriores en agua destilada, dejar reposar unos minutos, agitar bien y ajustar el pH a 7,4. ±0,1. Hervir durante 2 minutos, enfriar el medio de cultivo a 45 ~ 50 ℃ y verterlo en el plato. Cuando se utiliza, el tiempo de preparación no supera las 3 horas.
Diluyente Tamponado Fosfato Butterfield A1O
Líquido de almacenamiento
Dihidrogenofosfato de potasio 34,0 g
500 ml de agua destilada
Disolver dihidrógenofosfato de potasio en agua destilada y ajustar el pH a pH 7,2 con aproximadamente 175 ml de hidróxido de sodio de 1 mol/l. Agregue agua destilada hasta 1000 ml y guárdelo en el refrigerador. El diluyente es 1,25 ml de solución original, dilúyalo con agua destilada hasta 1000 ml, distribúyalo en recipientes adecuados y esterilice en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
Solución salina fisiológica A11
8,5 gramos de cloruro sódico
1000,0 ml de agua destilada
Disolver cloruro sódico en agua destilada, 0° C Autoclave durante 1215 minutos.
Tinción de Gram A12
Solución de tinción violeta cristal:
Violeta cristal 1,0g
Etanol 95% 20,0 ml
solución acuosa de oxalato de amonio al 1% 80. OmL
Disolver completamente el cristal violeta en etanol y luego mezclar con la solución de oxalato de amonio.
Solución de yodo gramo:
1,0 g de yodo
2,0 g de yoduro de potasio
300,0 ml de agua destilada
Primero agregue la mezcla de yodo y yoduro de potasio, agregue un poco de agua destilada y agite bien. Después de la disolución completa, agregar agua destilada hasta 300 ml.
Solución colorante amarillo arena:
Amarillo arena 0,25g
Etanol 95% 10,0ml
Agua destilada 90,0ml
Disolver la arena amarilla en etanol y luego diluirla con agua destilada.
Teñir...
A. Fijar la mancha sobre la llama, agregar gota a gota la solución de tinte violeta cristal, teñir durante 65438±0min y lavar con agua.
b.Añadir gota a gota la solución de yodo gramo, actuar durante 1 minuto y lavar.
C. Agregue etanol al 95% gota a gota para decolorar durante aproximadamente 15 ~ 30 segundos hasta que la solución de tinte se elimine. No decolorar demasiado, lavar con agua limpia.
d. Agregue la solución de contratinción gota a gota, tiña durante 1 minuto, lave, seque e inspeccione bajo el microscopio.
Resultados: Las bacterias Gram positivas son de color púrpura y las Gram negativas son rojas.
Reactivo Matriz Índigo de Kovacs A13
P-dimetilaminobenzaldehído 5,0 g
Alcohol amílico 75,0 ml
Ácido clorhídrico (concentrado) Disolver 25,0 ml de p-dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico, luego agregue lentamente ácido clorhídrico concentrado.
Indicador rojo de metilo A14
Rojo de metilo 0,1g
Etanol 95% 300 ml
Disolver rojo de metilo en 300 ml de etanol y diluir a 500 ml con agua.
Reactivo A15 Vogels-Proskauer (v-p)
Líquido para uñas
A-naftol 5,0 g
Ninguno 100,0 ml de agua etanol
B líquido
40,0 g de hidróxido de potasio
Añadir 100. Remojar en agua destilada.
Registro adicional b
La tabla de valores más cercanos (MPN) está en la muestra de 1g.
(Suplemento)
Se utilizó el método de los tres tubos y las cantidades de inoculación fueron 0,1, 0,01 y 0,00 microgramos respectivamente.
Número de tubo positivo MPNNúmero de tubo positivo MPN
0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001
0 0 0 & lt3 2 0 0 9.1
0 0 1 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6.1 2 1 1 20
0 1 2 9.2 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
p>0 2 0 6.2 2 2 0 21
0 2 1 9.3 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9.4 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 3,6 3 0 0 23
1 0 1 7,2 3 0 1 39
p>1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7.3 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
p>1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1100
13329333 >;1100
Nota: ① Esta tabla utiliza tres diluciones [0,1 g (mL), 0,0 lg (mL), 0,001 g (mL)] y cada dilución se inocula en tres tubos.
② Si las muestras enumeradas en la tabla se cambian a 1 g (mL), 0,18 (mL), 0,01 g (mL), los números de la tabla deben reducirse 10 veces: si se cambia a 0,01 g (ml), 0,0065438+.