Cómo extraer ADN del cabello
1. Introducción a los métodos de extracción de ADN
Para estudiar el papel de las moléculas de ADN en el metabolismo vital, a menudo es necesario extraer ADN de diferentes materiales biológicos debido a su naturaleza. de las moléculas de ADN en los organismos, la distribución y el contenido son diferentes, por lo que se deben seleccionar materiales apropiados para extraer el ADN.
Entre los animales y las plantas, el timo de ternero, el hígado de animales, el esperma de pez y los embriones de semillas de plantas contienen abundante ADN.
Entre los microorganismos, las bacterias del ácido glutámico contienen 7-10, la levadura de panadería contiene 4, la levadura de cerveza contiene 6 y los coliformes contienen 9-10.
Existen diferentes métodos para extraer ADN de diversos materiales, y la dificultad de separación y extracción también es diferente.
Para criaturas inferiores. Por ejemplo, es relativamente fácil extraer ADN de virus. La mayoría del ADN viral tiene un peso molecular pequeño, por lo que es fácil mantener su integridad estructural durante la extracción.
Es más difícil extraer ADN de bacterias y de animales y plantas superiores. El ADN bacteriano tiene un peso molecular relativamente grande, que generalmente alcanza 2×10 Daltons. Por lo tanto, es fácil que se corte por tensión mecánica. El ADN bacteriano, además del ADN nuclear, también incluye ADN plasmídico.
1. Propiedades físicas y químicas de los ácidos nucleicos
El ARN y los nucleótidos purificados son un polvo o cristal blanco, mientras que el ADN es una fibra blanca similar al amianto. A excepción del ácido inosínico y el ácido guanosina, que tienen sabor umami, la mayoría de los ácidos nucleicos y nucleótidos tienen un sabor amargo.
El ADN, el ARN y los nucleótidos son todos compuestos polares. Generalmente son solubles en agua e insolubles en disolventes orgánicos como el etanol y el cloroformo. Sus sales de sodio son más solubles en agua que los ácidos libres. El ARN tiene una solubilidad en agua que puede alcanzar los 40 g/l. El ADN es de 10 g/L en agua y es una solución coloidal viscosa. En soluciones ácidas, el ADN y el ARN se hidrolizan fácilmente y son más estables en soluciones neutras o débilmente alcalinas.
El ADN en su estado natural existe en el núcleo en forma de desoxirribonucleoproteína (DNP). Al extraer ADN de las células, primero extraiga el DNP, luego elimine el P y luego elimine el azúcar, el ARN y los iones inorgánicos de las células para separar el ADN de ellas.
La solubilidad del DNP y RNP en soluciones salinas se ve afectada por la concentración de sal. El DNP es casi insoluble en soluciones salinas de baja concentración. Por ejemplo, la solubilidad de 0,14 mol/L de cloruro de sodio es la más baja, solo 1 de la solubilidad en agua. A medida que aumenta la concentración de sal, la solubilidad también aumenta, alcanzando 1 mol/. L cloruro de sodio. La solubilidad en agua es muy alta, 2 veces mayor que la del agua pura.
La solubilidad del RNP en solución salina se ve menos afectada por la concentración de sal, y su solubilidad es mayor en 0,14mol/L de cloruro de sodio. Por tanto, este método se utiliza habitualmente para separar estas dos proteínas nucleares durante la extracción.
2. Disrupción celular
Las bacterias tienen paredes celulares duras y las células deben romperse primero. Hay tres métodos
: ① Método mecánico: tratamiento ultrasónico, trituración, homogeneización; ② Método de reactivo químico: tratar las células con SDS ③ Método enzimático: agregar lisozima o helicasa, se pueden usar ambos para descomponer la célula; muro.
Dado que el ADN de los animales superiores existe principalmente en el núcleo y las mitocondrias, existen dos dificultades para extraerlo (las plantas superiores son similares):
① Es difícil romper las células ; ¿cómo matar a los animales? Se necesita mucho tiempo para separar el tejido y romper las células. Durante este período, la ADNasa puede degradar el ADN, y los tejidos animales, especialmente el tejido muscular, son difíciles de romper. Incluso los tejidos del hígado, los riñones y otros tejidos que se rompen fácilmente suelen utilizar homogeneizadores de tejidos, que pueden provocar fácilmente la rotura del ADN.
②El peso molecular es grande, generalmente 2-3 órdenes de magnitud mayor que el de las bacterias y 4-5 órdenes de magnitud mayor que el de los virus. Para diferentes materiales biológicos, se deben seleccionar métodos apropiados de separación y extracción según las circunstancias específicas.
3. Varios métodos de extracción de ADN
(1). Método de sal concentrada
Utilizando la diferente solubilidad de RNP y DNP en la solución electrolítica, los dos. Para la separación, el método comúnmente utilizado es extraer con cloruro de sodio 1 M. El moco de DNP obtenido se agita con cloroformo que contiene una pequeña cantidad de octanol para emulsionar y luego se centrifuga para eliminar la proteína. En este momento, el gel de proteína permanece en el. fase acuosa y fase de cloroformo en el medio, mientras el ADN está en la fase acuosa superior, use 2 veces el volumen de etanol 95 para precipitar la sal de sodio del ADN.
También puede usar una solución de 0,15 MNaCL repetidamente. lave la solución de alteración celular para eliminar RNP y luego use NaCL 1 M para extraer la proteína desoxirribosa y luego use el método de cloroformo-isool para eliminar la proteína.
Al comparar los dos métodos, el último método puede. causan menos degradación de los ácidos nucleicos.
Al extraer ADN con una solución diluida de ácido clorhídrico, agregar una cantidad adecuada de detergente, como SDS, puede ayudar a separar las proteínas y el ADN. Durante el proceso de extracción, para inhibir la degradación del ADN por la DNasa en el tejido, se agrega citrato de sodio a la solución de cloruro de sodio como agente de fusión para los iones metálicos. Generalmente, NaCL 15 M, citrato de sodio 0,015 M, denominados colectivamente solución SSC. , se utiliza para extraer ADN.
(2). Método de detergente aniónico:
Utilice SDS o xilato de sodio y otros detergentes para desnaturalizar las proteínas, y el ADN se puede extraer directamente del material biológico. materiales Debido a que el ADN y las proteínas en las células a menudo están unidos por atracción electrostática o enlaces de coordinación. Debido a que los detergentes aniónicos pueden destruir este enlace de valencia, los detergentes aniónicos a menudo se usan para extraer el ADN.
El fenol, como desnaturalizante de proteínas, también inhibe la degradación de la ADNasa. Cuando el homogeneizado se trata con fenol, el enlace entre la proteína y el ADN se ha roto y la superficie de la molécula de proteína contiene muchos polares. El grupo es similar al fenol y es miscible. Las moléculas de proteínas se disuelven en la fase de fenol, mientras que el ADN se disuelve en la fase acuosa. Después de la centrifugación, retire la capa acuosa y repita la operación varias veces. Luego combine las fases acuosas que contienen ADN. Aprovechando la insolubilidad de los ácidos nucleicos en alcohol, use etanol para precipitar el ADN. En este momento, el ADN es una sustancia muy viscosa y se puede enrollar en una bola con vidrio y sacarla. La característica de este método es mantener el ADN extraído en su estado natural.
(4) Método de extracción con agua:
Utilizando la propiedad del ácido nucleico de disolverse en agua, después. rompiendo las células del tejido, use una solución baja en sal para eliminar el ARN, luego disuelva el precipitado en agua para disolver completamente el ADN en agua. Recoja el sobrenadante después de la centrifugación. Agregue cloruro de sodio sólido al sobrenadante para ajustarlo a 2,6 M. el volumen de etanol 95 y mezclar inmediatamente, agitar, luego lavar con etanol 66-80 y 95 y propileno de cobre respectivamente, y finalmente secar al aire para obtener la muestra de ADN extraída por este método. tiene un alto contenido de proteínas, por lo que generalmente no se utiliza. Para eliminar la proteína, puedes Este método se mejoró agregando SDS durante el proceso de extracción.