Cómo hacer tu propio medio de cultivo, que es algo parecido al agar
El medio es como el suelo, que es la base para la supervivencia y desarrollo de materiales in vitro en cultivo de tejidos. Por lo tanto, en todos los aspectos del cultivo de tejidos, debemos centrarnos en dominar el medio de cultivo y comprender su composición y métodos de preparación.
1. Cinco tipos de ingredientes que componen el medio de cultivo
Actualmente, la mayoría de los medios de cultivo están compuestos por nutrientes inorgánicos, fuentes de carbono, vitaminas, sustancias reguladoras del crecimiento y aditivos orgánicos. -ons. Compuesto por cinco tipos de sustancias.
1. Nutrientes inorgánicos
Los nutrientes inorgánicos están compuestos principalmente por macroelementos y oligoelementos. Entre los macroelementos, las fuentes de nitrógeno suelen incluir nitrógeno nitrato o nitrógeno amónico, pero el nitrógeno nitrato se utiliza principalmente en el. También se mezclan medio de cultivo y nitrógeno nitrato y nitrógeno amónico. El fósforo y el azufre suelen proceder de los fosfatos y sulfatos. El potasio es el catión principal en el medio de cultivo y su cantidad ha aumentado gradualmente en los medios de cultivo modernos. Los requerimientos de calcio, sodio y magnesio son menores. El sodio y el cloruro necesarios para el medio de cultivo los aportan sales de calcio, fosfatos o micronutrientes. Los oligoelementos incluyen yodo, manganeso, zinc, molibdeno, cobre, cobalto y hierro. La mayoría de los iones de hierro del medio de cultivo existen en forma de hierro quelado, es decir, una mezcla de FeSO4 y Na2-EDTA (agente quelante).
2. Fuente de carbono
Los tejidos o células vegetales cultivadas tienen una fotosíntesis débil. Por lo tanto, es necesario agregar algunos carbohidratos al medio de cultivo para cubrir las necesidades. El carbohidrato del medio de cultivo suele ser sacarosa. Además de servir como fuente de carbono y fuente de energía en el medio de cultivo, la sacarosa también juega un papel importante en el mantenimiento de la presión osmótica del medio de cultivo.
3. Vitaminas
Añadir vitaminas al medio de cultivo suele ser beneficioso para el desarrollo de los explantes. Las vitaminas del medio de cultivo pertenecen a las vitaminas del grupo B, entre las que las más eficaces son la vitamina B1, la vitamina B6, la biotina, el pantotenato cálcico y el inositol.
4. Aditivos orgánicos
Incluidos los aditivos orgánicos sintéticos o naturales. Los más utilizados son el hidrolizado de caseína, el extracto de levadura, el jugo de coco y diversos aminoácidos. Además, el agar es también el aditivo orgánico más utilizado. Se utiliza principalmente como soporte del medio de cultivo para que el medio de cultivo esté en estado sólido para facilitar el cultivo de diversos explantes.
5. Sustancias reguladoras del crecimiento
Las sustancias reguladoras del crecimiento utilizadas habitualmente generalmente incluyen las siguientes tres categorías:
(1) Auxinas vegetales. Como el ácido indolacético (IAA), el ácido naftalenoacético (NAA), el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D).
(2) Citoquinina. Como la zeatina (Zt), 6-bencilpurina (6-BA o BAP) y cinetina (Kt).
(3) Giberelina. Sólo hay un tipo de giberelina que se utiliza en cultivos de tejidos, el ácido giberélico (GA3).
2. Fórmulas de medios de cultivo más utilizadas y sus características
1. Fórmulas de medios de cultivo más utilizadas
El éxito del cultivo de tejidos depende en gran medida de la elección de la base cultural. Los diferentes medios de cultivo tienen diferentes características y son adecuados para diferentes especies de plantas y materiales de inoculación. Al realizar actividades de cultivo de tejidos, se deben comprender y analizar diversos medios para poder seleccionarlos y utilizarlos. A continuación se presentan las fórmulas de varios medios comúnmente utilizados para el cultivo de tejidos; consulte la Tabla 9-1.
Los tipos y cantidades de hormonas en el medio de cultivo varían según las diferentes etapas de cultivo y materiales, por lo que no se incluyen en cada fórmula.
2. Características de varios medios de cultivo utilizados habitualmente.
(1) Medio de cultivo MS. El medio MS es un medio de uso común en la actualidad. Tiene una alta concentración de sales inorgánicas, lo que resulta muy beneficioso para asegurar los nutrientes minerales necesarios para el crecimiento de los tejidos y acelerar el crecimiento de los callos. Debido a la alta concentración de iones en la fórmula, incluso si algunos ingredientes son ligeramente diferentes durante la preparación, almacenamiento, desinfección, etc., el equilibrio entre los iones no se verá afectado. El medio sólido MS se puede utilizar para inducir callos o para cultivar embriones, segmentos de tallo, puntas de brotes y anteras. Su medio líquido puede lograr un éxito evidente cuando se utiliza para el cultivo en suspensión celular. La cantidad y proporción de nutrientes inorgánicos en este medio son apropiadas y suficientes para cubrir las necesidades nutricionales y fisiológicas de las células vegetales.
Nota: Las sales de hierro no figuran en cada fórmula de medio de la tabla. En cuanto a la fórmula de la sal de hierro, excepto el medio de cultivo Nish que es citrato de hierro 10 mg/L, los demás son: 5,57 gramos de FeSO4·7H2O (sulfato ferroso) y 7,45 gramos de Na2-EDTA (tetraacetato de etilamina disódica) Solución en 1 litro de agua, 5 ml/l.
Deben añadirse ingredientes adicionales orgánicos como aminoácidos, hidrolizado de caseína, extracto de levadura y zumo de coco. En comparación con los componentes básicos de otros medios de cultivo, el medio de cultivo MS contiene altos contenidos de nitrato, potasio y amonio, que es su característica obvia.
(2)B5 medio. La característica principal del medio B5 es que contiene poco amonio, porque el amonio puede tener un efecto inhibidor sobre el crecimiento de muchos cultivos. Después de los experimentos, se descubrió que los cultivos de callos y suspensiones de algunas plantas crecían mejor en el medio MS que en el medio B5, mientras que otras plantas eran más adecuadas en el medio B5.
(3)N6 medio. El medio N6 es especialmente adecuado para el cultivo de anteras y polen de plantas de cereales y se utiliza ampliamente en el país y en el extranjero. En el cultivo de tejidos se utilizan a menudo el medio White (While, 1963), el medio Nitsch (1951), etc. Son muy parecidos en ingredientes básicos. El medio de White es más adecuado para el cultivo de tejidos de plantas leñosas debido a su menor cantidad de sales inorgánicas.
3. Preparación del medio de cultivo
1. Preparación del licor madre
Para evitar preparar decenas de medios de cultivo cada vez
Químico
Al pesar los medicamentos, los diversos componentes del medio de cultivo deben pesarse 10 veces, 100 veces o 1000 veces la cantidad original para preparar una solución concentrada. Esta solución concentrada se llama licor madre. De esta forma, cada vez que prepares un medio de cultivo, toma 1/10, 1/100 o 1/1000 de la cantidad total y dilúyelo para formar un medio de cultivo. A continuación se describen los métodos para preparar aguas madre a partir de diversas sustancias en la solución de cultivo.
(1) Gran cantidad de elementos. Los macroelementos incluyen nitrato de amonio y varios otros compuestos que se utilizan en grandes cantidades. Al preparar pesar y disolver 10 veces la cantidad en el orden que aparece en la tabla, luego mezclarlos en orden y finalmente agregar agua destilada hasta que la cantidad total llegue a 1 litro, que es la licor madre del macroelemento.
(2) Oligoelementos. Debido a que la dosis es pequeña, para la conveniencia y precisión del pesaje, se debe preparar en 100 o 1000 veces el licor madre. Durante la preparación, la cantidad de cada compuesto se aumenta 100 o 1000 veces, se disuelve y se mezcla sucesivamente para formar una solución madre de oligoelementos.
(3) Sal de hierro. La sal de hierro se debe preparar por separado. Se prepara disolviendo 5,57 gramos de sulfato ferroso (FeSO4·7H2O) y 7,45 gramos de etilendiaminotetraacetato disódico (Na-EDTA) en 1 litro de agua. Por cada litro de medio de cultivo añadir 5 ml de sal de hierro.
(4) Materia orgánica. Se refiere principalmente a aminoácidos y vitaminas. Se pesan por separado y se preparan a la concentración requerida (0,1 a 1,0 mg/ml). Cuando se utilizan, se añaden según la cantidad requerida en la fórmula del medio de cultivo.
(5) Hormonas vegetales. Los más utilizados son las auxinas y las citoquininas. Estas sustancias se utilizan en concentraciones muy bajas, generalmente de 0,01 a 10 mg/L. El licor madre se puede preparar en 100 o 1000 veces la dosis. Al prepararlo, pese cada producto individualmente y guárdelo por separado.
Al preparar auxina vegetal, el fármaco debe pesarse según la concentración requerida, colocarse en un vaso de precipitados pequeño o matraz aforado, disolverse con 1 a 2 ml de hidróxido de sodio 0,1 N (concentración equivalente en gramos) y luego se añadió Diluir con agua destilada hasta la concentración deseada. Al preparar citoquinina, primero disuélvela con una pequeña cantidad de ácido clorhídrico 0,5 o 1 N y luego agrega agua destilada hasta la cantidad requerida.
Las mezclas anteriores (licores madres) o medicamentos preparados individualmente deben conservarse en frigorífico para evitar su deterioro y crecimiento de moho. En cuanto a sacarosa, agar, etc., puedes utilizarlos según sea necesario según los requisitos de la fórmula.
2. Operaciones específicas para la preparación de medios de cultivo
①Según los requisitos de la fórmula, utilice una probeta o pipeta para sacar la cantidad requerida de cada solución madre y colocarla en la misma. vaso de precipitados, y utilice una balanza gruesa para pesar la sacarosa y el agar y reservarlos para su uso posterior.
② Añadir de 300 a 400 ml de agua destilada al agar pesado ①, calentar y remover continuamente hasta que hierva, se disuelva y se vuelva transparente, luego dejar de calentar.
③Agregue varias sustancias (incluida la sacarosa) tomadas en ① al agar cocido, agregue agua hasta 1000 ml, revuelva uniformemente y prepare un medio de cultivo.
④ Use hidróxido de sodio 1 N o ácido clorhídrico y colóquelo en el medio de cultivo en ③. Solo deje caer unas pocas gotas a la vez, revuelva uniformemente después de dejar caer y pruebe el valor de pH con papel de prueba de pH hasta que el cultivo. El medio es El valor del pH se ajusta a 5,8.
⑤ Utilice un embudo para distribuir el medio de cultivo preparado en un matraz Erlenmeyer (o tubo de ensayo), tape bien la boca del frasco con un tapón de algodón y escriba un número en la pared del frasco. La cantidad de medio de cultivo en la botella es aproximadamente 1/4 o 1/5 de su capacidad.
Los componentes del medio de cultivo son relativamente complejos para evitar que se pierdan algunos componentes debido a confusión durante la preparación, puede preparar una lista de ingredientes para preparar el medio de cultivo y completar todos los componentes y la dosis. el medio de cultivo con claridad. A la hora de prepararlo, sigue el orden del contenido de la tabla y pesa por artículo y cantidad, así no habrá errores. El formato y contenido de la lista de ingredientes se muestran en la Tabla 9-2.
3. Esterilización y almacenamiento del medio de cultivo
Una vez preparado el medio de cultivo, se debe esterilizar inmediatamente. El medio de cultivo normalmente debe esterilizarse en un esterilizador de vapor de alta presión a 120°C en la fase de vapor durante 20 minutos. Si no hay un esterilizador de vapor de alta presión, también se puede utilizar el método de esterilización intermitente, es decir, hervir el medio de cultivo durante 10 minutos y luego hervir durante 20 minutos después de 24 horas. Después de tres esterilizaciones consecutivas, se completa la esterilización. se puede lograr.
Los medios de cultivo esterilizados deben almacenarse a 10°C. Especialmente los medios que contienen sustancias reguladoras del crecimiento se almacenan mejor a una temperatura baja de 4 a 5°C. Los medios de cultivo que contienen ácido indol acético o giberelinas deben usarse dentro de una semana después de la preparación, y otros medios no deben exceder un mes como máximo. En la mayoría de los casos, debe utilizarse dentro de las dos semanas posteriores a la desinfección.