Resultados del gen myc
1. Resultados de la electroforesis en gel de agarosa por PCR: los cebadores diseñados experimentalmente amplificaron tres genes Myc. Después de la amplificación por PCR, el ADN del tejido canceroso de laringe y las células del tejido normal se pueden ver en las 2 bandas electroforéticas. menos de 300 pb. La primera banda es una banda sintética de dos fragmentos de ADN, N-myc (230 pb) y L-myc (227 pb) Dado que la diferencia entre los dos es de sólo 3 pb, la electroforesis en gel de agarosa no puede separarlos y mostrar una banda; La segunda banda de electroforesis es el gen C-myc (244 pb). Escanee la película negativa de los resultados de la electroforesis con un escáner láser para obtener los valores del área máxima de las dos bandas. La banda C-myc de células de tejido normal es más débil que la banda sintética de N-myc y L-myc, y la proporción es inferior a 1. El valor promedio de C×(N+L) de células de tejido normal es 0,6.
Múltiplo de amplificación de C-myc = C×(N+L)×0,6 de cáncer de laringe. Teniendo en cuenta los factores integrales del experimento, se determina que hay una amplificación de C-myc de más de 1,5. veces. Los resultados mostraron que el 42% de los cánceres de laringe tenían amplificación de C-myc, mientras que las células del tejido normal no tenían amplificación de C-myc.
2. Resultados de la electroforesis en gel de poliacrilamida neutra por PCR: debido a las características de separación del ADN de la electroforesis en gel de poliacrilamida neutra, la banda de electroforesis del gen Myc después de la amplificación por PCR mostró 3 bandas. La primera banda es L-myc (227 pb), la segunda banda es N-myc (230 pb) y la tercera banda es C-myc (244 pb). El corte de gel con la banda de electroforesis del gen Myc específica amplificada se escaneó directamente en el escáner láser para obtener el valor del área máxima de las tres bandas. Luego divida el valor del área del pico respectivo por el número de base respectivo como el número de copia única del gen. Establezca el número de copia único más pequeño entre L-myc, N-myc y C-myc como 1, y compare los otros múltiplos relativos de 2. genes. El valor medio de L-myc:N-myc:C-myc en células de tejido normal es 1,0:2,2:3,8. Resultados Entre los 32 casos de cáncer de laringe, el 47% tenía amplificación de L-myc y C-myc, y el 41% tenía amplificación de N-myc. La tasa de amplificación de C-myc fue básicamente consistente con los resultados detectados mediante electroforesis en gel de agarosa-PCR (χ = 0,254, P>0,614). 1. Muestras: se obtuvieron 32 casos de tejidos de cáncer de laringe de pacientes hospitalizados en el Departamento de Otorrinolaringología de nuestro hospital, 7 casos de tejidos de laringe normales se obtuvieron de pacientes sin cáncer hospitalizados en nuestro departamento durante el mismo período y 3 casos de tejidos de color blanco normal. Las células sanguíneas se obtuvieron de sangre entera humana del banco de sangre de nuestro hospital. Todas las muestras fueron confirmadas patológicamente. Según los diferentes grados de diferenciación patológica del cáncer de laringe, se divide en cánceres altamente, moderadamente y poco diferenciados.
2. Cebadores de PCR: 5′-CCCAGCGAGACATCTGGAAGAA-3′, 5′-GAGAAGCCGCTCCACATGCAGTC-3′. El Instituto de Genética de la Universidad de Fudan en Shanghai amplificó y sintetizó tres genes de la familia de genes Myc, a saber, C-myc (244 pb), N-myc (230 pb) y L-myc (227 pb).
3. Reactivos: la TaqDNA polimerasa y el dNTP son productos de Promega Company; la proteinasa K es un producto de Merke Company. El fragmento es un producto de Sigma Company. 1. Extracción de ADN plantilla: consulte el método en la referencia [3].
2. Amplificación por PCR: El volumen total de reacción de la amplificación por PCR es de 50 μl, utilizando 50 ng de ADN molde y operando en un instrumento de amplificación de ADN (Perkin Elmer Cetus). durante 1 minuto y 55°C 1 minuto, 72°C durante 2 minutos, y después de 30 ciclos, agregar 72°C durante 7 minutos.
3. Paso de electroforesis en gel de agarosa: tomar 5 μl de producto de PCR y agregar 1 μl de tampón de carga (0,25 % azul de bromofenol, 0,25 % cianuro de xileno FF, 40 % solución acuosa de sacarosa) y reservar. Prepare un gel de agarosa al 2% y viértalo en un tanque de electroforesis horizontal. Después de que el gel se solidifique, agregue la muestra, use tampón TAE 1x como tampón de electrodo y tiña con bromuro de etidio. El voltaje debe ser inferior a 5 V/cm durante aproximadamente 2 horas. Después de la electroforesis, el gel se observó directamente en un transiluminador UV. Después de tomar las fotografías, los negativos se escanean en un escáner láser.
4. Paso de electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante: tomar 5 μg de producto de PCR y agregar 1 μl de tampón de carga y reservar. Prepare un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 8% y viértalo en un tanque de electroforesis de placa vertical de 20 cm × 20 cm × 0,1 cm. Después de que el gel se polimerice, agregue la muestra y use 1 × tampón TBE como tampón de electrodo a temperatura ambiente. Se llevó a cabo a 1 vatio durante aproximadamente 14 horas y la electroforesis se detuvo cuando el indicador azul de bromofenol se movió hasta el borde. El gel después de la electroforesis se transfirió a una placa cuadrada para tinción con nitrato de plata. El proceso de tinción es el siguiente: lavar el gel 3 veces con agua bidestilada (dH2O), luego remojarlo en la solución colorante (1 g de nitrato de plata, agregar dH2O a 500 ml) durante 30 minutos, retirar la solución colorante, enjuagar el gel 3 veces con dH2O y luego sumérjalo en la solución cromogénica (NaOH 15 g, 38% formaldehído 3,8 ml, agregue dH2O a 500 ml) durante aproximadamente 10 minutos. Cuando aparezcan bandas de ADN marrones y negras, lave el gel una vez. dH2O y luego sumergirlo en la solución de parada de sombra (ácido acético glacial 25 ml, agregar agua a 500 ml) durante aproximadamente 30 minutos, luego mover el gel al fijador (25 ml de etanol, 2,5 ml de ácido acético glacial, agregar dH2O a 500 ml) para su fijación. El gel fijado se observa y se fotografía en un visor de películas y el gel se escanea directamente con un escáner láser.
Los tres genes tienen dos regiones que son altamente homólogas en el segundo exón. Los tres genes expresan proteínas independientes y sus efectos fisiológicos son básicamente los mismos. Los estudios han demostrado que el gen Myc se amplifica o se expresa de manera anormal en muchas células tumorales, pero en diferentes tejidos tumorales y líneas celulares cancerosas, los miembros de la familia de genes Myc tienen algunas diferencias en la amplificación o expresión. Por tanto, es de gran importancia seguir estudiando la relación entre los tres miembros del gen Myc y los tumores humanos. La tecnología de escaneo láser de electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante establecida en este estudio puede detectar simultáneamente la amplificación de tres genes Myc en tejidos tumorales. Durante el desarrollo de tumores, es necesario comprender los respectivos mecanismos de acción de los tres genes. proporciona medios experimentales simples.