¿Cómo dibujar la curva estándar de alicina?
1.1 Materiales experimentales
Ajo morado desintoxicado (condado de Cheng, Longnan).
1.2 Instrumentos experimentales
Equipos balanza electrónica, centrífuga refrigerada de alta velocidad, espectrofotómetro UV-visible, lámpara fluorescente, baño maría, probeta graduada, tubo de centrífuga, vaso de precipitado, matraz aforado, turno graduado Tubos de líquido, bolsas de diálisis, etc.
1.3 Reactivos experimentales
Tionina, dihidrogenofosfato de sodio, hidrogenofosfato disódico, polivinilpirrolidona (pvp), metionina (Met), NBT, riboflavina, sacarosa, Antrone, acetato de etilo, sulfúrico concentrado ácido, etc
2 Métodos experimentales
2.1 Extracción y determinación de la actividad de la superóxido dismutasa del ajo
2.1.1 Método de extracción crudo Tomar 10g de ajo desintoxicado en preenfriado en el Mortero, agregue una cantidad adecuada de medio de extracción, muélalo hasta obtener un homogeneizado en un baño de hielo, luego agregue el medio de extracción para lavar el mortero, de modo que el volumen final sea de 200 ml. Tomar 100 ml y centrifugar a 10000 rpm-1 durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante es el extracto crudo de SOD.
2.1.2 Método de purificación: Moler con sulfato de amonio, agregar solución de extracción de SOD hasta alcanzar el 50% de saturación, colocar en refrigerador a 4°C durante 30 minutos, congelar y centrifugar a 10.000 rpm-1 durante 20 minutos para eliminar las proteínas extrañas. Luego agregue sulfato de amonio al sobrenadante hasta una saturación del 90%, colóquelo en un refrigerador a 4°C durante 2 horas y colóquelo a 65438.
2.1.3 Reacción de color: Tomar 4 tubos de ensayo con buena transparencia y la misma textura, 2 para medición y 2 para control (ver Tabla 1). Después de mezclar, use una cubierta de cartón negro de doble capa un poco más larga que el tubo de ensayo para cubrir 1 tubo de control y colóquelo bajo luz solar de 4000xl durante 20 a 30 minutos (se requiere que las condiciones de iluminación de cada tubo sean consistentes y la reacción La temperatura se controla entre 25 y 35°C (el tiempo debe ajustarse adecuadamente según la actividad enzimática).
2.1.4 Determinación y cálculo de la actividad SOD Después de la reacción, cubrir el tubo de ensayo con un paño negro para finalizar la reacción. Utilice el tubo de control de protección contra la luz como blanco, mida la absorbancia de cada tubo a una longitud de onda de 560 nm y calcule la actividad de SOD de acuerdo con la siguiente fórmula: Actividad de SOD = (A0-As) × vt/A0 × 0,5 × fw × v 1; actividad específica de SOD = actividad total de SOD/concentración de proteína. En la fórmula, la actividad total de SOD se expresa como unidades enzimáticas por gramo de peso fresco; las unidades de actividad específica se expresan como unidades de proteína por miligramo y unidades de enzima mg-1. A0 es responsable del valor de absorción fotométrica del tubo de control; el valor de absorción óptica del tubo de muestra AS; el volumen total de la solución de muestra VT (ml); Muestra de FW (g); la unidad de concentración de proteína es miligramos de proteína por gramo de peso fresco (mgg-1).
2.2 Determinación de azúcar soluble en ajo mediante método colorimétrico de antrona
2.2.1 Preparación de curva estándar
2.2.1.1.1 Pureza analítica de la solución estándar de sacarosa Se secó la sacarosa a 80°C hasta peso constante, se pesó con precisión 1.000 g, se añadió una pequeña cantidad de agua para disolver, luego se añadió 0,5 ml de ácido sulfúrico concentrado, se transfirió a un matraz volumétrico de 100 ml y se diluyó a volumen con agua destilada.
2.2.1.2 Solución estándar de sacarosa de 100 μg/L Extraiga con precisión 1 ml de solución estándar de sacarosa, agréguelo a un matraz volumétrico de 100 ml y agregue agua hasta la marca.
2.2.1.3 Prepare la curva estándar de sacarosa. Tome 11 tubos de ensayo de calibración de 20 ml, numérelos del 0 al 10 y agregue solución y agua de acuerdo con la Tabla 2. Luego agregue 0,5 ml de reactivo de acetato de etilo de antrona y 5 ml de ácido sulfúrico concentrado al tubo de ensayo en secuencia, agítelo bien, coloque inmediatamente el tubo de ensayo en un baño de agua hirviendo y mantenga la temperatura con precisión durante 65438 ± 0 minutos uno por uno. Después de sacarlo, enfríelo a temperatura ambiente de forma natural y use el blanco como referencia, mida la absorbancia a una longitud de onda de 630 nm, tome la absorbancia como ordenada y el contenido de azúcar como abscisa, dibuje una curva estándar. y resuelve la ecuación lineal estándar.
2.2.2 Extraer azúcar soluble
Tomar ajo fresco desintoxicado, limpiar la suciedad de la superficie, pesar 3,0 g, ***3 partes y triturar.
Poner en tres tubos de ensayo graduados, agregar 5 ~ 10 ml de agua destilada, sellar con film plástico, extraer en agua hirviendo durante 30 minutos (dos veces), filtrar el extracto en un matraz volumétrico de 25 ml, enjuagar los tubos de ensayo y el residuo repetidamente y ajustar el volumen a escala.
Determinación del color
Coloque 0,5 ml de extracto de muestra en un tubo de ensayo graduado de 20 ml (repita tres veces) y agregue 1,5 ml de agua destilada. Los siguientes pasos son los mismos que los de la medición de la curva estándar. Mida la absorbancia de la muestra y calcule el contenido de azúcar soluble.
Cálculo de resultados
Calcule el contenido de azúcar (μg) según la ecuación lineal estándar y calcule el contenido de la muestra de prueba según la siguiente fórmula.
Contenido de azúcar soluble = (cantidad de azúcar obtenida de la ecuación de regresión/volumen de solución de muestra absorbida) × volumen del líquido de extracción × factor de dilución)/(peso seco de la muestra × 106) × 100.
2.3 Extracción, separación y determinación de alicina
2.3.1 Proceso experimental: desintoxicación del ajo→pelado→limpieza→machacado→hidrólisis enzimática→extracción con disolvente→separación sólido-líquido → Sobrenadante → Concentrado a presión reducida → Concentrado de ajo.
2.3.2 Principio experimental La alicina es un líquido aceitoso de color amarillo claro, ligeramente soluble en agua y fácilmente soluble en etanol, benceno, éter y otros disolventes. Aprovechando esta propiedad, el aceite de ajo se puede extraer mediante disolventes. La elección del solvente es muy importante. Requiere que el solvente tenga suficiente solubilidad, sea fácil de separar después de la lixiviación (la diferencia del punto de ebullición es significativa) y trate de estar libre de otros malos olores y residuos de solvente. Dado que el aceite de ajo se utiliza principalmente en el ámbito alimentario, se eligió como agente de extracción el etanol, que es muy volátil y tiene poco impacto negativo en los seres humanos.
2.3.3 Efectos de la fracción de volumen de etanol, la cantidad de adición de etanol, la temperatura de extracción y el tiempo de extracción sobre el rendimiento de alicina en diferentes condiciones de extracción.
2.3.4 Determinación de alicina mediante espectrofotometría.
3 Análisis y resultados experimentales
3.1 Aislamiento y determinación de la actividad de la superóxido dismutasa del ajo desintoxicado
Al extraer crudamente la SOD del ajo desintoxicado, la SOD se purifica preliminarmente con amonio. método de sal de sulfato y la SOD se purifica mediante el método de diálisis. Finalmente, la actividad de SOD se midió espectrofotométricamente. Los resultados muestran (ver Tabla 3): Después de experimentos repetidos, se midió la actividad de SOD y el valor de absorbancia promedio A0 (valor de absorbancia fotométrica del tubo de control) a 560 nm fue 0,091 los valores promedio de AS (valor de absorbancia de; el tubo de muestra) fueron 0,0174, 0,014 y 0,0157. Se calculó que la actividad promedio de SOD era 5,460 y su actividad específica de SOD era 546 U/mg.
3.2 Determinación del contenido de polisacáridos del ajo desintoxicado
3.2.1 La preparación de la curva estándar de sacarosa adopta el método de dilución de concentración en gradiente para preparar 20 ug/mL, 40 ug/mL, 60 ug/mL y 80 ug/ Soluciones de sacarosa de ml y 100 ug/ml, miden sus valores de absorbancia a 630 nm respectivamente y luego dibujan una curva estándar de sacarosa basada en sus respectivos valores de absorbancia. Los valores de absorbancia específicos y la curva estándar se muestran en la Tabla 4 y la Figura 1. Según la curva estándar, la curva estándar es y (concentración de sacarosa ug/mL) = 0,0059x (valor de absorbancia A) - 0,0238, y la correlación es R2 = 0,9975. Muestra que la curva estándar es factible en el rango de concentración de sacarosa de 0-65438±000 μg/ml.
3.2.2 El contenido de azúcares solubles en el ajo detoxificado El contenido de polisacáridos solubles en el ajo detoxificado se determinó mediante el método colorimétrico de antrona. Los resultados mostraron (ver Tabla 5): Se midieron 6 especies en el ajo. 630 nm Repita el valor de absorbancia del azúcar soluble, el valor de absorbancia A está en el rango de 2,67-2,992. Después del cálculo, el contenido promedio de azúcar soluble en el ajo desintoxicado es de 485,75 ug/ml.
3.3 Extracción, separación y determinación de alicina
3.3.1 Efecto de la fracción en volumen de etanol sobre el rendimiento de alicina Tome 100 g de ajo fresco pelado, divídalo en 5 partes iguales y guárdelo en Calentar a 40 ℃ durante 1 h y luego agregar 80 ml de etanol con fracciones de volumen de 95, 90, 85, 80 y 75 a 30 °C. Después de la destilación al vacío, se midió el contenido de alicina en el producto. Los resultados se muestran en la Tabla 6.
Como puede verse en la Tabla 4, a medida que aumenta la fracción de volumen de etanol, también aumenta la producción de alicina, lo que también muestra que la alicina es fácilmente soluble en disolventes orgánicos y difícil de disolver en agua. Los experimentos muestran que cuando la fracción de volumen de etanol es 95, el rendimiento de alicina es el más alto, alcanzando 0,037 g/20 g.
3.3.2 Efecto de la adición de etanol sobre la producción de alicina: Triturar 100 g de ajo desintoxicado con una cantidad adecuada de tampón fosfato, colocar en un baño de agua a 40°C durante 1 hora, dividir en 5 partes iguales y luego se prensaron. Se añadieron 40 ml, 60 ml, 80 ml, 100 ml y 120 ml con etanol 95 a 30ºC. Como puede verse en la Tabla 5, la adición de etanol tiene un gran impacto en el rendimiento de alicina. A medida que aumenta la relación material-líquido, la producción de alicina aumenta gradualmente, pero la tasa de extracción de alicina aumenta rápidamente de 40 ml a 100 ml y aumenta lentamente después de 100 ml. Esto se debe a la relación material-líquido. aumenta. La tasa de extracción de alicina eventualmente se acercará a un valor límite, que es consistente con el coeficiente de distribución de alicina en la fase acuosa y la fase orgánica. Teniendo en cuenta muchos factores, como las materias primas y el consumo de energía, la eficiencia de extracción de 100 g de ajo con 100 ml de etanol 95 es la mejor y el contenido de alicina es de 0,039 g/20 g.
3.3.3 Efecto de la temperatura de extracción sobre el rendimiento de alicina Tomar 100g de ajo fresco pelado y dividirlo en 5 partes iguales. Agregue una cantidad adecuada de tampón fosfato y muela durante 65438 ± 0 h en un baño de agua a 40 ° C, luego agregue 65438 ± 000 ml de etanol 95 y extraiga 65438 ± 0,5 h a 25 ° C, 30 ° C, 35 ° C, 40 ° C, 45°C, y reducir la presión a 50°C. Destilar y determinar el contenido de alicina en el destilado. Puede verse en la Tabla 6 que la tasa de extracción de alicina disminuye con el aumento de la temperatura de extracción. Esto se debe a que cuanto mayor es la temperatura, más inestable es la alicina y menos alicina se transfiere a la fase orgánica. Cuando la temperatura de extracción es de 30°C, la tasa de extracción de alicina es la más alta y el contenido alcanza 0,038 g/20 g.
3.3.4 Efecto del tiempo de extracción sobre el rendimiento de alicina Tomar 100 g de ajo fresco pelado, dividirlo en 5 partes iguales, añadir una cantidad adecuada de tampón fosfato a cada una, triturar a 40 °C durante 1 hora, luego agregue 80 ml de etanol 95 a 30 ℃ durante 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 2 h, 2 h respectivamente. Puede verse en la Tabla 7 que a medida que aumenta el tiempo de extracción, la extracción de alicina primero aumenta y luego disminuye. Esto debería deberse a que el tiempo de extracción es demasiado corto y la alicina generada no se puede transferir completamente a la fase orgánica; si el tiempo de extracción es demasiado largo, la alicina se convierte fácilmente en otros subproductos; Los experimentos han demostrado que cuando el tiempo de extracción es de 65438 ± 0,5 h, la tasa de extracción de alicina es la más alta, alcanzando 0,038 g/20 g.
En resumen, los experimentos han demostrado que el ajo picado se extrajo durante 65438 ± 0 h a 40 °C, utilizando 65438 ± 000 ml de etanol 95 como extractante, y se extrajo durante 65438 ± 0,5 h a 30 °C. El mayor contenido de extracción de alicina fue 0,038 g/20 g (0,65438 ± 090).