Cómo se esterilizan normalmente los medios de cultivo, las placas de Petri y los materiales vegetales
1. El medio de cultivo se esteriliza mediante calor húmedo.
El medio de cultivo debe esterilizarse 24 horas después de su preparación. El principio de la esterilización a alta presión es: en una vaporera sellada, el vapor no puede escapar y la presión continúa aumentando, lo que hace que el punto de ebullición del agua siga aumentando, lo que hace que también aumente la temperatura dentro de la olla. Bajo una presión de 0,1 mpa, la temperatura en el recipiente alcanza los 121°C. A esta temperatura del vapor se pueden matar rápidamente diversas bacterias y sus esporas extremadamente resistentes al calor.
Tenga cuidado de eliminar completamente el aire del recipiente para que el recipiente se llene de vapor de agua y así la esterilización pueda ser completa. Hay varias formas diferentes de desinflar un esterilizador de vapor de alta presión, pero el propósito es descargar el aire, calentar la olla de manera uniforme y garantizar una esterilización completa. El método comúnmente utilizado es: cerrar la válvula de purga, encender la alimentación, cuando la presión aumenta a 0,05 mpa, abrir la válvula de purga para liberar el aire, esperar hasta que el puntero del manómetro vuelva a cero y luego cerrar la válvula de purga.
Cierre la válvula y vuelva a encender la alimentación. Cuando el manómetro suba a 0,1 mpa, inicie el temporizador y mantenga la presión en 0,1-0,15 mpa durante 20 minutos.
Los recipientes de diferentes tamaños tienen diferentes tiempos de mantenimiento de la presión. Ver Tabla 1. Los números que figuran en la tabla son muy seguros para una esterilización completa y el tiempo se puede acortar si el recipiente es grande pero el volumen es pequeño.
Tabla 1. Tiempo mínimo necesario para la esterilización en autoclave
Volumen del recipiente/ml
Tiempo mínimo necesario para la esterilización a 121°C/min
20-50
15
75-150
20
250-500
25
1000
30
Después de alcanzar el tiempo de mantenimiento de la presión, se puede cortar la energía. Cuando la presión alcance 0,5 mpa, se debe tener cuidado de no hacerlo. reduzca la presión demasiado rápido para evitar que el líquido en el recipiente se descomprima violentamente, hierva y se desborde. Cuando la presión cae a cero, se puede abrir la tapa, sacar el medio y colocarlo en la plataforma para que se condense. El tiempo de desinflado no puede ser demasiado largo, de lo contrario provocará cambios en la composición del medio, haciendo imposible colocar el medio en la pendiente. Una vez que se deja por mucho tiempo, la tapa no se puede abrir debido a la presión negativa generada en la caldera. Mientras se abra la válvula de ventilación, entre presión atmosférica y se equilibren las presiones interna y externa, la tapa se abrirá. fácilmente.
Para artículos que no se deteriorarán después de la esterilización a alta presión, como agua esterilizada, medios de cultivo, herramientas de inoculación, etc., el tiempo de esterilización se puede extender adecuadamente o se puede aumentar la presión. El medio de cultivo debe cumplir estrictamente con el tiempo de mantenimiento de la presión. No solo debe mantener la presión a fondo, sino también evitar que los componentes del medio de cultivo se deterioren o reduzcan la potencia del medio de cultivo. El tiempo de mantenimiento de la presión no se puede extender a voluntad. .
La esterilización a alta presión también se puede utilizar para algunos productos de tela, como batas de laboratorio y mascarillas. Después de lavarlos y secarlos, colóquelos en bolsas de plástico de alta presión y esterilice en autoclave durante 20-30 minutos.
El pH del medio de cultivo disminuyó entre 0,2 y 0,3 unidades antes y después del autoclave. La dirección y magnitud del cambio en el pH del medio de cultivo después del tratamiento en autoclave depende de una variedad de factores. Cuando el medio contiene un solo componente y el medio contiene sustancias de alta concentración o superior, el cambio de pH después del autoclave será mayor, incluso mayor que 2 unidades de pH. Los cambios en el pH ambiental de más de 0,5 unidades pueden tener efectos fisiológicos importantes.
El autoclave normalmente hidroliza la sacarosa del medio de cultivo en azúcares simples, cambiando así la presión osmótica del medio de cultivo. En el rango de contenido de sacarosa del 8% al 20%, el medio de cultivo después del tratamiento en autoclave aumentó aproximadamente 0,43 veces.
Durante el proceso de esterilización en autoclave, el hierro del medio de cultivo catalizará la hidrólisis de la sacarosa, provocando que entre el 15% y el 25% de la sacarosa se hidrolice en glucosa y fructosa. El medio con valores inferiores a 5,5 presenta mayor hidrólisis. Cuando se agrega un 0,1 % de carbón activado al medio de cultivo, la hidrólisis de la sacarosa a alta presión mejora considerablemente, y cuando se agrega un 1 % de carbón activado, la tasa de hidrólisis de la sacarosa puede alcanzar el 5 %.
Para evitar algunos de los cambios mencionados anteriormente en la esterilización a alta presión, se pueden utilizar los siguientes métodos:
(1) Siempre preste atención a recopilar información sobre el impacto de esterilización a alta presión sobre los componentes del medio de cultivo, de modo que se puedan tomar medidas oportunas y efectivas.
(2) Al diseñar la fórmula del medio de cultivo, intente utilizar reactivos estables con efectos similares y controle con precisión la dosis. Por ejemplo, evite el uso de fructosa y sorbitol y use manitol en su lugar, use IBA en lugar de IAA, controle la cantidad de carbón activado (menos del 0,1%) y preste atención al valor de pH de cada componente del medio de cultivo durante el autoclave, etc. .
(3) Al preparar el medio de cultivo, se debe prestar atención al orden razonable de agrupación y adición de los ingredientes. Por ejemplo, al final se añaden fósforo, calcio y hierro.
(4) Preste atención a los cambios y la dinámica de recuperación del valor de pH del medio de cultivo esterilizado en autoclave. Por ejemplo, el valor del pH suele aumentar de 5,8 a 6,48 durante el tratamiento en autoclave y bajará a aproximadamente 5,8 después de 96 horas. De esta manera, esta regla se puede dominar en experimentos.
2. Quemar y esterilizar el instrumental utilizado para las operaciones asépticas.
Durante las operaciones asépticas, sumergir pinzas, tijeras, bisturíes, etc. en alcohol al 95% y utilizar Retirar y esterilizar quemándolos. la llama de una lámpara de alcohol. Úselo inmediatamente después de enfriar. Durante el funcionamiento, se puede llenar con alcohol al 95 % una botella de boca ancha de 250 ml o 500 ml y se puede insertar la herramienta.
3. Esterilización por calor seco de cristalería y utensilios resistentes al calor.
La esterilización por calor seco utiliza un horno para calentar a una temperatura de 160-180 °C para matar los microorganismos. Debido a que en condiciones de calor seco, la resistencia al calor de las células vegetativas bacterianas mejora enormemente, acercándose al nivel de resistencia al calor de las esporas, generalmente se puede esterilizar a 170 °C en 90 minutos. Los artículos que se van a esterilizar con calor seco deben lavarse y secarse con anticipación, y las herramientas deben envolverse adecuadamente para evitar una nueva contaminación cuando se saquen después de la esterilización. Se puede envolver en plástico resistente a altas temperaturas. Durante la esterilización, la temperatura debe elevarse gradualmente hasta alcanzar la temperatura predeterminada y se debe registrar el tiempo. La cantidad de elementos colocados en el horno no debe ser demasiada para evitar impedir la convección y penetración del calor. Apague la alimentación después del tiempo especificado y espere hasta que se enfríe por completo antes de abrir el horno para evitar que el recipiente se rompa debido a un enfriamiento repentino. . La esterilización por calor seco consume demasiada energía y es una pérdida de tiempo.
4. Las sustancias resistentes al calor se esterilizan mediante filtración.
Algunos reguladores del crecimiento, como las giberelinas, la zeatina, el ácido giberélico y ciertos microorganismos, son esterilización por vapor a alta presión. no se puede utilizar y generalmente se utiliza la esterilización por filtro.
Algunos componentes químicos se degradarán bajo altas temperaturas y presión y perderán su eficacia o reducirán su eficacia. La actividad de la giberelina GA3 después del tratamiento en autoclave es sólo el 10% de la de la solución nueva sin tratamiento en autoclave. La sacarosa se degradará parcialmente en d-glucosa y d-fructosa después de altas temperaturas, y la fructosa se hidrolizará parcialmente para producir sustancias que inhiben el crecimiento de tejidos vegetales cultivados. Las altas temperaturas también hacen que reaccionen los carbohidratos y los aminoácidos. Las vitaminas tienen distintos grados de estabilidad térmica, pero la vitamina B1 se degrada rápidamente si el pH del medio de cultivo es superior a 5,5. El pantotenato de calcio y los extractos de tejido vegetal deben esterilizarse por filtración en lugar de esterilizarse en autoclave o perderán su eficacia.
El diámetro de la malla de la membrana del filtro antibacteriano es inferior a 0,45 micras. Cuando la solución pasa a través del filtrado, las células bacterianas y las esporas de hongos se bloquean porque son más grandes que el diámetro de la membrana del filtro. La cantidad de líquido que debe filtrarse y esterilizarse es grande. Cuando la cantidad de líquido es pequeña, se suele utilizar una jeringa. Antes de usar un autoclave para esterilizarlo, primero instale la membrana del filtro al lado de la jeringa, inyecte el líquido a filtrar en la jeringa, empuje el vástago de la jeringa y presione la solución para sacar la solución de la membrana del filtro. de la jeringa queda libre la solución bacteriana.
Procedimiento de desinfección del filtro: Primero, envolver el filtro y la botella receptora en papel. La membrana del filtro se puede colocar en la placa de Petri envuelta en papel. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 30 minutos antes de su uso; instalar el dispositivo filtrante en la mesa de trabajo ultralimpia, utilizar pinzas sin dientes esterilizadas para colocar la membrana filtrante sobre el diafragma, con el lado rugoso de la membrana filtrante hacia arriba; El líquido a descontaminar se inyecta en el filtro y se enciende la bomba de vacío para filtrar y esterilizar. El filtrado se puede almacenar después de que el cultivo demuestre que no hay crecimiento bacteriano.
5. Utilice rayos ultravioleta y fumigación para la esterilización del espacio.
(1) La esterilización ultravioleta se utiliza en la sala de inoculación, el banco de trabajo ultralimpio o la caja de inoculación. La esterilización ultravioleta utiliza factores de radiación para esterilizar. Después de que las bacterias absorben la luz ultravioleta, las estructuras de proteínas y ácidos nucleicos cambian, provocando mutaciones en los cromosomas bacterianos y provocando la muerte. La longitud de onda de los rayos ultravioleta es de 200 a 300 nanómetros, de los cuales 260 nanómetros tienen la mayor capacidad de esterilización. Sin embargo, debido a la débil capacidad de penetración de los rayos ultravioleta, solo es adecuado para la esterilización del aire y las superficies de objetos, y la distancia desde el. Se requiere que el objeto irradiado no tenga más de 1,2 arroz.
(2) La fumigación y la esterilización utilizan métodos como el calentamiento, la incineración y la oxidación para convertir los productos químicos en forma gaseosa y difundirlos en el aire, matando los microorganismos en el aire y en la superficie de los objetos. Este método es sencillo de utilizar y sólo requiere sellar el espacio de esterilización.
Existen muchos tipos de desinfectantes químicos que pueden desnaturalizar las proteínas microbianas, competir por el sistema enzimático de los microorganismos o reducir la tensión superficial de los microorganismos, aumentar la permeabilidad de las membranas plasmáticas de las células bacterianas y hacer que las células se desintegren. romperse o disolverse. En términos generales, cuanto mayor sea la temperatura y mayor el tiempo de acción, mejor será el efecto de esterilización. Además, dado que el desinfectante debe disolverse en agua para que sea eficaz, debe convertirse en un estado soluble en agua, como cloruro de mercurio, permanganato de potasio, etc. También está el hecho de que cuanto mayor es la concentración de un desinfectante, mayor es su capacidad esterilizante, a excepción del ácido carbólico y el alcohol.
El fumigante comúnmente utilizado es el formaldehído. Al fumigar, sellar la habitación, colocar el formaldehído en un recipiente de boca ancha en una cantidad de 5-8ml/m3 y agregar 5g/m3 de permanganato de potasio para su oxidación. y volatilización. Al fumigar, se puede rociar la habitación mojada con anticipación para mejorar el efecto. El ácido acético glacial también se puede utilizar para calentar y fumigar, pero no es tan eficaz como el formaldehído.
6. Aplique algunos productos químicos en la superficie del objeto para la esterilización por pulverización.
Puede aplicar algunos productos químicos en la superficie del objeto para la esterilización por pulverización. Por ejemplo, los escritorios, las paredes, las manos, las superficies de material vegetal, etc. se pueden esterilizar aplicando repetidamente alcohol al 75 %, una solución de Lysol al 1 %-2 % y una solución de Xinjiazil al 0,25 %-1 %.
7. Esterilizar la superficie de los materiales vegetales con desinfectantes
Los materiales vegetales seleccionados del exterior o del interior contienen diversos microorganismos en distintos grados. Una vez que estos contaminantes ingresan al medio de cultivo, provocarán la contaminación del medio de cultivo. Por lo tanto, el material vegetal debe someterse a un estricto tratamiento de esterilización superficial para luego ser inoculado en el medio de cultivo mediante un procedimiento estéril, proceso llamado inoculación. El material vegetal inoculado se denomina explante.
El agente antimicrobiano para cultivos vegetales (PPM) de Qiwei Yicheng es un agente antimicrobiano de amplio espectro que puede matar células bacterianas y fúngicas, prevenir la germinación de esporas de hongos y puede eliminar explantes en concentraciones más altas del cuerpo.
En primer lugar, retire el material vegetal cosechado de las partes no utilizadas y limpie cuidadosamente las partes deseadas, como frotando con un cepillo adecuado, etc. Corte el material en tamaños apropiados que puedan colocarse en recipientes esterilizados apropiados. Enjuague con agua corriente durante unos minutos a unas horas, dependiendo de qué tan limpio esté el material. Los materiales que flotan fácilmente o que son de tamaño pequeño se pueden lavar en una bolsa de gasa. El lavado con agua corriente es especialmente útil cuando la contaminación es grave.
Al lavar, puede agregar detergente en polvo para limpiar y luego enjuagar el agua en polvo con agua del grifo. El polvo para lavar ropa puede eliminar la suciedad ligeramente adherida a la superficie de las plantas, eliminar los lípidos y facilitar el contacto directo con el desinfectante. Por supuesto, la sustancia limpiadora más ideal es el tensioactivo Tween.
El segundo paso consiste en esterilizar la superficie del material mediante penetración. Esto debe hacerse en una mesa de trabajo o caja de inoculación limpia, y preparar vasos de precipitados esterilizados, varillas de vidrio, alcohol al 70%, desinfectante, agua esterilizada y relojes. Remojar en alcohol al 70% durante 10 a 30 segundos. Debido a que el alcohol tiene el efecto de humedecer la superficie de los materiales vegetales y la penetración de alcohol al 70% también puede matar fácilmente las células vegetales, el tiempo de infiltración no debe ser demasiado largo. Existen algunos materiales especiales, como frutos, capullos de flores, botas envueltas en brácteas, brácteas y hojas, yemas latentes con múltiples capas de escamas, etc., así como materiales extraídos principalmente del interior, que se pueden tratar con solo 70 % alcohol. Puede tardar un poco más. El material procesado se evapora en condiciones estériles, luego se retira la capa exterior y se toma la capa interior de material.
El tercer paso es tratar con esterilizante. Hay muchos tipos de esterilizantes de superficie y se pueden seleccionar 1 o 2 para su uso según la situación (Tabla 2).
Tabla 2. Comparación de concentraciones y efectos de esterilizantes de uso común
Nombre del esterilizador
Concentración utilizada
Tiempo de esterilización/minutos
Efecto de esterilización
Alcohol
70-75%
0.1-3
Bueno
p>Cloruro de mercurio