Cómo hacer PCR inmune
1 Reactivo
Tampón de recubrimiento: Tris-HCI 20 mmol/L (pH 9,5), que contiene NaCl 150 mmol/L y NaN3 0,02 %;
Solución de lavado : Tris-HCI 20 mmol/l (pH 7,5), que contiene 150 mmol/LNaCl, EDTA 0,1 mmol/l y Tween20 al 0,1 %;
Diluyente: Tris-HCI 20 mmol/l (pH 7,5), que contiene NaCl 150mmol/L, leche desnatada al 0,45% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado (0,1mg/ml)
2 Operaciones
1) Recubrimiento
Uso Diluir el antígeno (BSA) en el tampón de recubrimiento, agréguelo a la placa de microtitulación (pocillo de 45 µl), incube a 4°C durante la noche (aproximadamente 15 horas) y lave la placa 3 veces con solución de lavado durante 5 minutos.
2) Bloqueo:
Añadir 200 μl de Tris-Hcl de 20 mmol/L que contenga 4,5 % de leche desnatada y ADN de esperma de salmón desnaturalizado (1 mg/ml) y EDTA 0,1 mmol/L a cada uno. pocillo (pH 7,5) (que contiene 150 mmol/L de tampón NaCl, incubar a 37 °C durante 80 minutos, lavar la placa varias veces.
3) Reacción antígeno-anticuerpo:
Utilice una solución de liberación 1: anticuerpo monoclonal anti-BSA diluido al 8000, agregue 50 μl a cada pocillo, incube a temperatura ambiente (~22 ℃) durante 45 minutos, lave los pocillos 15 veces x 10 minutos para eliminar las moléculas de anticuerpo no unidas.
4) Reacción de unión estreptavidina-proteína A:
Añadir 50 μl de estreptavidina-proteína A quimérica diluida con diluyente que se ha combinado con biotina-pUC19 en cada pocillo. a temperatura ambiente (~ 22 ° C) durante 50 minutos para permitir que la quimera-pUC19 se una al complejo antígeno-anticuerpo en fase sólida. Luego lave la placa 15 veces x 10 minutos y luego lávela 3 veces sin NaN3. Placa TBS para posteriores reacciones de PCR.
5) PCR
Condiciones experimentales: 50 mmol/L KCI, 10 mmol/L Tris-HCI (20 °C, pH 8,3), 1,5 mmol/LMgCl2, gelatina (10 μg/ml) , 0,8 mmol/LdNTP (0,2 mM cada uno), cebadores 2 μM (1 μM cada cebador) y TaqDNA polimerasa (50 U/ml).
Ciclo de PCR Antes de la PCR, irradie la mezcla de reacción anterior con luz ultravioleta (UV) (254 nm), luego agréguela al pocillo de la placa de microtitulación, 40 μl por pocillo, agregue 20 μl de parafina irradiada con UV para cubrir, presione PCR los ciclos se realizaron en la máquina de PCR a las temperaturas anteriores: desnaturalización inicial a 94°C durante 5 min; desnaturalización a 94°C durante 5 min, recocido a 58°C durante 1 min, extensión a 72°C durante 1 min; y extensión final a 72°C durante 5 min. El producto de PCR obtenido fue un fragmento específico de 261 pb. ⒈ Diluir la solución bacteriana a una determinada concentración con NaCl al 0,85%.
⒉ Añadir 50μl a la microplaca e incubar a 4°C durante la noche. Al mismo tiempo, configure un control negativo (agregue 50 µl de NaCl al 0,85 % a otro pocillo).
⒊ Lavar cinco veces con 400μl de 20pBS tibio al 0,05% (en lo sucesivo denominado TPBS).
⒋ Añadir 100 μl de PBS de suero normal de cabra (NGS) al 2,25 % para bloquear durante 2 horas.
⒌ Lavar 3 veces con TPBS que contenga 0,15 % de NGS.
⒍ Añadir 100 μl de anticuerpo monoclonal (que contiene 100 μg de ADN de esperma de pescado fresco) diluido adecuadamente con NGS al 0,75 % e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
⒎ Lavar cinco veces con TPBS.
⒏ Añadir 50 μl de anticuerpo IgG anti-ratón biotinilado apropiadamente e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
⒐ Lavar cinco veces con TPBS.
⒑Añadir 60 µl de ADN biotinilado adecuadamente diluido y cebador de afinidad e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
⒒Lavar cinco veces con TPBS y luego tres veces con agua grado HPLC.
⒓Amplificación por PCR: agregar 50 μl de solución de reacción de PCR (que contiene cebadores T3 y T7), 95 ℃ 60 s, 50 ℃ 110 s, 72 ℃ 110 s, ciclo 30 veces. Tome 10 μl del producto de PCR y ejecútelo en un gel de agarosa al 1,7% para electroforesis. estándar de peso molecular del ácido nucleico. La banda de electroforesis encontrada en la posición correspondiente es positiva. Si es necesario, tome fotografías de los resultados de la electroforesis para el análisis cuantitativo. 1) El sistema de detección de gel utiliza un escáner de gel o un equipo de video asistido por computadora para cuantificar la amplificación. de etiquetas radiactivas en geles de agarosa o poliacrilamida teñidos con bromuro de etidio. El producto se puede determinar cuantitativamente mediante autorradiografía. Recientemente, se ha utilizado un secuenciador de ADN automático para detectar ácidos nucleicos marcados con fluorescencia. Este método puede medir con precisión el tamaño del producto amplificado. y su sensibilidad de detección alcanza el nivel fg. Sin embargo, debido al secuenciador automático de ADN y al etiquetado fluorescente, los cebadores son extremadamente caros, por lo que ahora se utilizan sólo para investigación.
2) Sistema de detección HPLC La ventaja de este método es que no es necesario purificar el producto de PCR, la sensibilidad de los productos sin etiquetar puede alcanzar el nivel fg y el límite de detección de los productos etiquetados puede ser menor. La HPLC puede distinguir diferentes tamaños de moléculas, lo que nos permite utilizar estándares internos de diferentes tamaños para medir la eficiencia de la amplificación.
3) El sistema de medición en fase sólida más comúnmente utilizado es una placa de microtitulación de poliestireno de 96 pocillos, que se puede utilizar para colorimetría o lectura con un instrumento. La placa de titulación se puede recubrir con moléculas de avidina mediante hidrófoba. Esta fase sólida El sistema puede unirse específicamente a biotina o moléculas biotiniladas y puede usarse para cuantificar productos de PCR biotinilados. Por ejemplo, los productos de amplificación doblemente marcados con biotina y digoxigenina pueden cuantificarse mediante el método de placa de microtitulación. cuantificado Hay tres formas de etiquetar simultáneamente productos de PCR con digoxigenina: ① Agregar digoxigenina y análogos de desoxinucleótidos marcados con biotina (DIG-/Bio-dUTP) simultáneamente a la mezcla de reacción ② Agregar cebadores biotinilados 1 y DIG-dUTP; 1 y cebador 2 marcado con digoxigenina. El método cuantitativo es el siguiente: el producto de amplificación doblemente marcado se precipita con etanol para eliminar el marcador no unido y luego se agrega a una placa de microtitulación recubierta de avidina y se incuba durante al menos 2 horas. Después de lavarlo varias veces, se mezcla con DIG. anticuerpo: AP La incubación del conjugado puede producir diferentes colores dependiendo de su sustrato. La tecnología de captura en fase sólida mediada por avidina de moléculas diana marcadas con biotina es una tecnología eficaz, flexible y fácil de operar, y se convertirá en una tecnología clave. a la tecnología de PCR cuantitativa.
4) El sistema SPA (Scintillation Proximity Assay) utiliza microesferas de flúor recubiertas de avidina como portadores de fase sólida, cebadores marcados con biotina y nucleótidos fluorados incorporados durante la amplificación. Una vez completada la amplificación, se añaden microesferas de flúor recubiertas. para capturar el producto de PCR biotinilado. Este proceso de captura se puede combinar estrechamente con las microesferas de flúor, y el deuterio excita el flúor para generar pulsos de luz, que se pueden medir con un contador de centelleo. Este método tiene un rango lineal mayor en comparación con los métodos colorimétricos.
5) El sistema de detección de hibridación por puntos desnaturaliza el producto amplificado y lo fija en la superficie de la membrana de nailon, y lo hibrida con la sonda de ADN marcada. También puede pasar la sonda oligonucleotídica específica de secuencia a través de poli. La cola -T (poli T) se fija en la membrana y se hibrida con el producto de amplificación marcado desnaturalizado. En este último, debido a que el gen diana no está directamente unido a la superficie de la membrana, su cinética de reacción es cercana a la de la fase líquida. y la velocidad de reacción es rápida. Generalmente se utilizan sondas biotiniladas o productos de amplificación que se producen con conjugados de avidina-AP para producir manchas de color que se cuantifican comparando la intensidad del color con estándares de concentración conocida.
6) El sistema de detección por electroquimioluminiscencia une el producto amplificado a perlas magnéticas a través del sistema avidina-biotina, y luego lo marca con quelato de 2,2'-bipiridil-rutenio (TBR). La sonda se hibrida con tripropilamina. (TPA) se agrega y se transfiere a la celda de detección del instrumento de electroquimioluminiscencia. Cuando el voltaje del electrodo aumenta a un cierto nivel, tanto el TPA como el TBR se oxidan instantáneamente. El TPA se oxida para generar un intermedio inestable y altamente reductor. Sustancia que puede reaccionar con TBR oxidado para entrar en un estado excitado. Cuando cambia del estado excitado al estado fundamental, puede emitir luz de 620 nm. La intensidad luminosa es proporcional a la cantidad de etiqueta TBR. Por luminiscencia La intensidad cuantifica la PCR. Producto La sensibilidad de este método es el nivel de amol y se puede medir automáticamente.
7) El sistema de inmunoensayo enzimático de ADN utiliza anticuerpos monoclonales anti-ADN para unirse a los productos de amplificación y luego realiza una determinación cuantitativa a través de conjugados de anticuerpos secundarios enzimáticos. Este método no requiere etiquetado de cebadores ni productos de amplificación, pero la fácil aparición de reacciones cruzadas y el alto costo de los anticuerpos monoclonales limitan la amplia aplicación de este método.
8) El método de detección de fluorescencia inducida por láser utiliza primero el derivado éster de N-hidroxisuccinimida de la etiqueta fluorescente FAM (nombre comercial) para acoplarlo al 5' del cebador directo a través del brazo de enlace aminohexilo. -Nucleótido, luego amplificación por PCR, electroforesis capilar para amplificar el producto y, finalmente, utilizar un detector de fuente de luz láser de iones de argón para detectar la intensidad de la fluorescencia para la determinación cuantitativa. Las ventajas de este método son que requiere menos muestra, se puede detectar automáticamente, es rápido, sensible y tiene alta resolución.
En resumen, el método anterior se puede utilizar para cuantificar genes diana y su precisión se puede mejorar mediante ensayos multiplex y el uso de estándares internos para estandarizar los datos. Debido a que la tecnología de captura en fase sólida mediada por avidina de moléculas diana marcadas con biotina es efectiva, flexible y fácil de operar, tiene buenas perspectivas de aplicación clínica. La PCR cuantitativa todavía tiene problemas técnicos y actualmente se utiliza principalmente para la investigación, pero habrá una demanda cada vez mayor de esta tecnología en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades tumorales, bacterianas, fúngicas y virales.