¿Qué es la cultura enriquecida?

Las muestras obtenidas deben manipularse, almacenarse y transportarse a 4°C. Si la muestra está congelada, debe mantenerse congelada hasta el momento de realizar la prueba.

Poner 25 ml de líquido o 25 g de muestra semisólida o sólida en un vaso de homogeneización que contenga 225 ml de caldo de enriquecimiento reactivo no selectivo (EB), y luego transferir a un matraz Erlenmeyer, incubar. a 30°C durante 4 horas, luego agregar los reactivos selectivos acriflavina, ácido nalidíxico y cicloheximida, y continuar incubando durante 20 horas y 44 horas. ..

2. Aislamiento

* * *Después de 24 horas y 48 horas de cultivo, realice el cultivo de EB en placas de agar que contengan OXA y LPM o escina/Fe3 LPM. El agar Parkan puede sustituir al agar LPM. Las placas OXA y Parcam se incubaron a 35°C durante 24-48 horas y las placas LPM se incubaron a 30°C durante 24-48 horas. Luego, coloque la placa LPM en la mesa de disección con luz incidente desde un ángulo de 450 grados. Mire hacia abajo a través del ocular y busque colonias sospechosas. Listeria aparece en color azul o gris brillante en las placas LPM. Como controles se utilizaron placas etiquetadas con bacterias positivas y negativas conocidas.

La placa LPM adicionada con escina y Fe3 no requiere sistema de iluminación oblicua, y el método de selección de colonias sospechosas es el mismo que para las placas OXA. Hay un anillo negro alrededor de la colonia de Listeria en la placa OXA. Otras bacterias también pueden formar un anillo negro, pero tarda más de dos días en formarse. Las características de las colonias de Listeria monocytogenes fueron similares en las placas Palcam y OXA.

Seleccione 5 o más colonias típicas de placas Palkam y OXA o LPM y sepárelas en placas Zeafield respectivamente para obtener colonias individuales más puras y típicas. En la inspección de alimentos, la purificación en placas TSAYE es necesaria porque pueden estar presentes microorganismos inhibidores invisibles al aislar colonias de placas Palcan y OXA o LPM. La razón para elegir cinco colonias representativas es que se puede aislar más de una especie de Listeria de una muestra. Las placas TSAYE se cultivaron a 30°C.

3. Pasos de identificación

(1) Observe la placa TSAYE, use luz oblicua para buscar colonias de color azul grisáceo a azul azulado y use bacterias conocidas en TSAYE como control. .

(2) Seleccione colonias típicas de placas TSAYE cultivadas a 30 °C o menos, haga portaobjetos húmedos y observe bajo un microscopio de aceite. Se prepararon portaobjetos húmedos a partir de una suspensión bacteriana en solución salina al 0,85%. Si la cantidad de bacterias es demasiado baja, las bacterias se pegarán al portaobjetos y no mostrarán movimiento. Listeria género Brevibacterium, ligeramente rotando y dando vueltas. En comparación con los controles conocidos de Listeria, no es esférico, tiene forma de varilla grande y nada rápidamente.

(3) Se seleccionaron colonias típicas para la prueba de catalasa y Listeria mostró una reacción positiva para la catalasa.

(4) Tomar 16-24 h de cultivo para la tinción de Gram. Listeria es Gram positiva. Pero habrá cambios en la tinción de Gram de cultivos antiguos y las bacterias pueden ser esféricas. En los portaobjetos teñidos excesivamente, las bacterias suelen estar dispuestas en forma de cuadrícula y pueden confundirse fácilmente con la difteria.

(5) Seleccione colonias típicas e inocúlelas en tubos de caldo TSBYE, cultívelas a 35 °C durante 24 horas y realice experimentos bioquímicos como la fermentación del azúcar. Los tubos de caldo TSBYE pueden almacenarse a 4°C durante varios días o inocularse repetidamente.

(6) Seleccionar colonias típicas de la placa TSAYE e inocularlas en 5 placas de agar sangre de oveja o sangre de caballo, evitando tocar el fondo de la placa y dañar el agar. Al mismo tiempo, se establecieron y cultivaron a 35°C durante 48 horas un control positivo (Listeria monocytogenes y Listeria ovis) y un control negativo (Listeria innovadoraa). Listeria monocytogenes exhibe un anillo beta-hemolítico estrecho.

(7) Bajo una luz intensa, observe la placa de agar sangre perforada. Listeria monocytogenes y Listeria sylvestriae producen β-hemólisis clara alrededor del punto de punción, mientras que Listeria innovans no produjo hemólisis, Listeria melitensis produjo grandes. Anillos hemolíticos con bordes claros. No se intenta aquí diferenciar entre especies, sino más bien documentar las características de la reacción hemolítica. La prueba CAMP puede distinguir reacciones hemolíticas entre ellas.

(8) Prueba de reducción de nitratos (opcional).

Inocule el cultivo del caldo TSBYE en el caldo de nitrato, cultívelo a 35 °C durante 5 días, agregue 0,2 ml de reactivo A y luego agregue 0,2 ml de reactivo B y mezcle hasta que el color púrpura sea positivo, lo que indica que el nitrato se ha reducido. . Si no hay color, agregue una pequeña cantidad de polvo de zinc al tubo de ensayo y déjelo durante 1 hora. Si el morado es rojo, significa nitratos. No reducido por bacterias. Sólo L. murica reduce los nitratos, por lo que esta prueba única es necesaria para diferenciar entre L. murica y L. gordonii. Existe una prueba equivalente a esta prueba, es decir, después de añadir 0,2mL de reactivo A y 0,2mL de reactivo C, se ha reducido el nitrato. Si no hay reacción de color, agregue una pequeña cantidad de polvo de zinc. Si hay color naranja, significa que el nitrato no se ha reducido.

(9) Perforar el cultivo TSBYE en tubos de ensayo SIM y MTM y cultivarlos a temperatura ambiente durante 7 días. La observación diaria muestra que Listeria crece en la típica forma de paraguas, que es más típica en MTM. Al mismo tiempo, se puede observar el recambio bacteriano bajo un microscopio de aceite a 30°C en el cultivo TSBYE.

(10) Inocular el cultivo de caldo TSAYE en tubos de fermentación de glucosa, maltosa, escina, manitol, ramnosa y xilosa de 0,5 (p/v) (se pueden seleccionar tubos de fermentación invertidos), cultivados a 35 °C durante 7 días. La Listeria positiva produce ácido pero no gas. La Listeria fermenta la ramnosa y la xilosa como se muestra en la siguiente tabla. El manitol no puede ser fermentado excepto por Listeria. Si el pigmento de la colonia es evidente en las placas de separación OXA, Parcan o LPM que contienen escina/Fe3, se puede omitir la prueba de escina.

La diferencia entre Listeria

Tipos

Lisis de glóbulos rojos

Nitrato

Fermentación de azúcar

Manitol

Rhamnosa

Xilosa

Listeria

-

-

-

Listeria

-

-

-

V

-

Listeria wilsonii

-

-

-

V

Listeria sylvestriae

-

-

-

Listeria Griffith

-

-

V

-

Listeria ovis

-

-

-

v: Respuesta incierta

4. Identificación serológica

La siguiente tabla muestra las relaciones serológicas entre especies de Listeria.

Relaciones serológicas de Listeria

Tipos

Serotipos

Listeria

1/2A, 1/2B, 1/2C, 3A, 3B, 3C, 4A, 4AB, 4B, 4C, 4D, 4E, "7"

Listeria ovis

Cinco

Listeria

4AB, 6A, 6B, ONU (indeterminado)

Listeria Wilson

6A, 6B

Listeria sylvestridia

1/2B, 4C, 4D, 6B, UN (pendiente)

Colocar cultivos de caldo TSBYE Inocular en 3 ml de caldo TSBYE y cultivar a 35 ℃ durante 24 h Inocular dos inclinaciones de agar de Chua y. cultivo a 35 ℃ durante 24 h. El césped bacteriano inclinado se lavó con 3 ml de tampón fosfato de 0,01 mol/l, la suspensión bacteriana se calentó en un baño de agua a 80°C durante 65.438 ± 0 horas y se centrifugó a 2500 r/min durante 30 minutos, y se agregaron 2 ml. fue descartado.

5. Prueba de toxicidad en ratones

Inocular la cepa aislada en 10 mL de caldo TSBYE, cultivar a 35°C durante 24 horas, centrifugar el cultivo, concentrar y utilizar 1.010 bacterias/ mL fisiológico Preparar suspensión bacteriana con solución salina, tomar 0,1 mL para inyección intraperitoneal y pesar 16.

6.Prueba de hemólisis colaborativa

En la placa de agar sangre de oveja, inocular en paralelo Staphylococcus aureus β-hemolítico (Staphylococcus aureus) y Rhodococcus equi (Rhodococcus equi), las bacterias sospechosas. se inoculan verticalmente entre los dos, y los dos son similares pero no se cruzan. Incubar a 30°C durante 24 h-48 h y observar el efecto del punto de inoculación vertical sobre el anillo de hemólisis. La hemólisis de Listeria monocytogenes aumenta cerca del sitio de inoculación de S. aureus, al igual que la hemólisis de Listeria lindoni.