Utilizando levaduras sacarificantes diploides A y B como cepas iniciales, pretendemos utilizar tecnología de hibridación sexual para generar cepas de enzimas sacarificantes de alto rendimiento y diseñar un plan experimental de mejoramiento.

No coincide con el título, pero espero que pueda usarse como referencia 1. Principio experimental La historia de vida de la levadura pertenece al tipo doble unisexual. Sus células haploides y células diploides generalmente pueden dividirse. sin restricción. Las levaduras con células predominantemente haploides se denominan levaduras haploides, como por ejemplo Schizosaccharomyces pombe. Las levaduras con células principalmente diploides se denominan levaduras diploides, como la levadura de cerveza (también conocida como levadura de panadería, Saccharomycescerevisiae). Estas dos levaduras se utilizan a menudo como materiales para la investigación genética, y la levadura de cerveza tiene un gran valor de aplicación en la industria cervecera y alimentaria. En este experimento, se utilizó una cepa haploide heterotálica de S. cerevisiae para experimentos de hibridación. Cualquier cepa de levadura, si las células vegetativas diploides se colocan en condiciones de formación de esporas, sufrirá meiosis para producir tétradas y ascas. Cada ascospora tiene cuatro núcleos moleculares. Normalmente, hay 4 ascosporas en el asco, entre las cuales hay 2 a y 2 α. A y α representan dos tipos de cigosidad opuestos. Las ascosporas con estos dos tipos de cigosidad germinan y crecen en cepas haploides, y las células de cepas haploides de diferentes tipos de cigosidad se fusionan para producir una cepa diploide. Las levaduras con tal ciclo de vida se denominan levaduras heterocigotas. La historia de vida de la madre heteróloga de alcohol de cerveza se muestra en la Figura 11-1. Las cepas haploides pertenecen a dos tipos cigóticos, a y α, que están controlados por un par de alelos a y α. El locus de este par de alelos está cerca del centrómero en el tercer grupo de enlace. Es muy difícil observar los cromosomas de la levadura con un microscopio óptico, pero con la ayuda de la microscopía electrónica hemos aprendido más sobre la citología de la levadura. Ahora se sabe que la levadura de cerveza tiene 17 grupos de enlace (n=17). Dos cepas haploides de levadura auxotróficas pertenecientes a diferentes tipos de cigosidad no pudieron formar colonias en un medio mínimo. Cuando se cruzan para formar células híbridas diploides, pueden crecer en medios mínimos. Durante la formación de ascosporas en células híbridas diploides, se produce recombinación cromosómica, lo que da como resultado rasgos recombinantes en las ascosporas producidas. 2. El propósito del experimento es comprender la historia de vida y la ley de combinación de genes libres de la levadura de cerveza heteróloga a través de experimentos de hibridación de levaduras y dominar los métodos básicos de hibridación de levaduras. 3. Materiales experimentales 1. Deficiencia de adenina haploide de Saccharomyces cerevisiae (ade-), el tipo de conjugación es a; 2. Deficiencia de histidina haploide de Saccharomyces cerevisiae (Hisl-), el tipo de conjugación es α. 4. Equipos experimentales y medicamentos 1. Utensilios: tubos de ensayo, tubos de centrífuga, centrífugas, pipetas, placas de petri, matraces Erlenmeyer, varillas de recubrimiento, arena de cuarzo. 2. Fármacos: suero fisiológico (0,85 gramos de NaCl disueltos en 100 ml de agua destilada, esterilizados a 15 libras de presión durante 15 minutos), celulasa o helicasa. 3. Medio de cultivo: (1) Medio de cultivo líquido completo: 2 gramos de peptona, 1 gramo de extracto de levadura, 2 gramos de glucosa, 100 ml de agua, pH 6,0, esterilizado a 8 libras de presión durante 30 minutos. (2) Medio de cultivo sólido completo: agregue 2% de agar al medio de cultivo líquido completo. (3) Medio de cultivo líquido básico: 10 g de glucosa, 1 g de (NH4)2SO4, 0,125 g de K2HPO4, 0,875 g de KH2PO4, 1 ml de solución madre de KI*, 0,5 g de MgSO4·7H2O, 0,1 g de CaCl2 ·2H2O y NaCl0 1 gramo, solución madre de oligoelementos** 1 ml, solución madre de vitaminas** 1 ml, agua 1000 ml, pH 5,3, esterilizado a 8 libras de presión durante 30 minutos. *Solución madre de KI: 10 mg de KI en 100 ml de agua. **Licor madre de oligoelementos: H3PO41 mg, ZnSO4·7H2O7 mg, CuSO4·5H2O1 mg, CoCl2·6H2O5 mg, agua 100 ml. ***Solución madre de vitaminas: niacina 40 mg, vitamina B140 mg, inositol 200 mg, riboflavina 20 mg, ácido p-aminobenzoico 20 mg, piridoxina 40 mg, ácido pantoténico 40 mg, biotina 0,2 mg, 100 ml de agua. (4) Medio sólido básico: Añadir 2% de agar al medio líquido básico.

(5) Medio de producción de esporas: CH3COONa 8,2 g, KCl 1,86 g, piridoxina líquida de levadura*1 ml, licor madre de ácido pantoténico** 1 ml, licor madre de biotina*** 1 ml, agar 20 g, agua destilada 1000 ml. *Solución madre de piridoxina: 20 mg de piridoxina/100 ml de agua. **Solución madre de ácido pantoténico: 20 mg de ácido pantoténico/100 ml. ***Solución madre de biotina: 2 mg de biotina/100 ml. (6) Medio de cultivo suplementario: a. Añadir 3,5 mg de histidina a 100 ml de medio de cultivo sólido básico. b. Añadir 3 mg de adenina a 100 ml de medio sólido básico. 5. Pasos experimentales 1. Tome 4 tubos de ensayo que contengan inclinaciones de medio sólido completo. Inocular las dos cepas de ade- e Hisl- en las dos vertientes. Incubar en una incubadora a 30°C durante 24 horas. 2. Utilice 5 ml de solución salina fisiológica para lavar las bacterias en la inclinación de un ade-, luego viértalo en otro tubo de ensayo de ade y, finalmente, vierta las bacterias lavadas en un tubo de centrífuga estéril. Tome otros 5 ml de solución salina fisiológica para lavar las bacterias en la pendiente de los tubos de ensayo Hisl-dos y viértalos en un tubo de centrífuga estéril. La concentración del líquido bacteriano así preparado es de aproximadamente 108/ml. 3. Aspire 0,5 ml de cada solución bacteriana original, colóquelos en 5 ml de medio de cultivo líquido completo e incube estáticamente a 30 °C durante 2 horas. 4. Centrifugar (3000 rpm, 3 minutos) e incubar a 30°C durante media hora. 5. Verter el sobrenadante, mezclar la masa bacteriana en el fondo del tubo, luego añadir 6 ml de medio de cultivo líquido completo fresco y cultivar a 30°C durante la noche. 6. Centrifugar y desechar el sobrenadante. Añadir 6 ml de medio de cultivo líquido completo fresco, lavar una vez, centrifugar y desechar el sobrenadante. 7. Inocular las bacterias precipitadas en el tubo de centrífuga en la inclinación del medio productor de esporas y cultivarlas a 30°C durante 2-3 días. Observe el asco formado después de la hibridación bajo un microscopio y podrá ver que contiene 4 ascosporas. 8. Determine el fenotipo de las ascosporas e infiera su genotipo: (l) Agregue 2 ml de solución de cultivo básico a la pendiente con el asco, raspe el asco con un asa de inoculación y viértalo en un tubo de centrífuga estéril. (2) Calentar en un baño de agua a temperatura constante a 55°-60°C durante 15 minutos para matar el cuerpo vegetativo de la levadura, es decir, las células haploides. Centrifugar, eliminar el sobrenadante y agregar solución salina fisiológica al volumen original para formar una suspensión de ascus. (3) Verter la suspensión de esporas en un matraz Erlenmeyer esterilizado lleno de arena de cuarzo y agitar durante 5 minutos para dispersar las ascosporas y convertirlas en una suspensión de ascosporas. (4) Tome 0,1 ml de la suspensión de ascosporas dispersas y extiéndalos en una placa de cultivo de medio completo y cultívelo a 30 °C durante 48 horas. (5) Fotocopiar el cultivo: utilizar la placa de cultivo anterior como placa de cultivo original y copiar en orden: a. Medio suplementado con adenina; Incubar a 30°C durante 48 horas. (6) Identificación del espectro de crecimiento: a. Elija cada colonia bacteriana identificada preliminarmente de la placa de cultivo original e inocúlela en la inclinación del medio completo. Al mismo tiempo, inocular en un tubo de centrífuga con 5 ml de medio de cultivo completo líquido y cultivar a 30°C durante 48 horas. b. Centrifugar (3000 rpm, 3 minutos), verter el sobrenadante, batir uniformemente el precipitado, luego centrifugar y lavar tres veces y finalmente agregar solución salina fisiológica al volumen original. C. Tome 0,1 ml de solución bacteriana y transfiéralo a una placa de Petri vacía esterilizada. Luego vierta el medio de cultivo básico sólido que se haya derretido y enfriado a 40°-50°C, agite bien y espere hasta que solidifique. Haz 1 plato para cada uno. d. Divida cuatro compartimentos en el fondo de cada placa de Petri, coloque una pequeña cantidad de polvo de cristal de histidina en dos compartimentos y coloque una pequeña cantidad de polvo de cristal de adenina en los otros dos compartimentos. Luego colóquelo en una incubadora a 30°C durante 48 horas. e. Observe el crecimiento. Las cepas auxotróficas crecerán alrededor de las sustancias requeridas. Si se necesitan dos sustancias, sólo puede crecer donde ambas sustancias se difunden. Los pasos de la operación se muestran en la Figura 11-2. 9. Descripción de los pasos experimentales: (1) Los pasos 3 a 6 consisten en cultivar células frescas en un medio rico en nutrientes y contactar completamente con células de diferentes tipos de conjugación para formar cigotos. condiciones para que se produzcan las esporas. (2) En el paso 7, dado que la levadura no proliferará en el medio de esporulación, es necesario inocular suficientes células para que el número de ascus formados por hibridación no sea demasiado pequeño. (3) Paso 8 (3), para obtener ascosporas de las ascosporas, también puede usar helicasa para tratar completamente las ascosporas y luego usar un tratamiento ultrasónico para dispersar completamente las ascosporas. La temperatura del tratamiento con helicasa es de 30°-37°C, 15-30 minutos.

Sin helicasa, vibrar con arena de cuarzo también puede romper la cáscara del asco y liberar las ascosporas. (4) La levadura es un hongo unicelular y no forma hifas, por lo que se puede utilizar el método de fotocopia en el paso 8 (5). 6. Resultados experimentales 1. Resultados de la fotocopia: la capacidad de crecer se representa con "+", la que no puede crecer se representa con "-" y se cuenta el número de colonias. 2. Identificación del espectro de crecimiento: 3. Compare la fotocopia con los resultados de la identificación del espectro de crecimiento para ver si las conclusiones son consistentes. 4. Explicación de los resultados experimentales: La cepa haploide auxotrófica de levadura de cerveza utilizada en este experimento, los genes relacionados ade e Hisl pertenecen a diferentes grupos de enlace y son una combinación libre de dos pares de genes. Por lo tanto, en los resultados experimentales, la proporción de genotipos haploides debe ser ++:ade-:Hisl-:ade-Hisl-=1:1:1:1. La proporción fenotípica de las cepas haploides también debería ser 1:1:1:1. La proporción de segregación fenotípica refleja directamente la proporción de segregación genotípica.