Cómo obtener variedades de alto rendimiento a partir del cultivo

La separación (separación) de cepas bacterianas consiste en separar una muestra mezclada con varios microorganismos mediante tecnología de separación y utilizar métodos rápidos, precisos y eficaces para separarlos y cribarlos de acuerdo con los requisitos reales y las características de la cepa, y. luego el proceso de obtención de los microorganismos requeridos. Aunque el aislamiento y la detección de cepas son dos pasos, no se pueden separar completamente porque algunas medidas aisladas tienen en sí mismas un efecto de detección. La detección de bacterias productoras de microbios industriales generalmente incluye dos partes: una es aislar las cepas requeridas de la naturaleza y la otra es purificar aún más las cepas de tipo salvaje aisladas e identificar metabolitos.

En el trabajo experimental, para lograr el doble de resultado con la mitad de esfuerzo en la selección, en términos generales, la recolección y la selección se pueden realizar de las siguientes maneras:

(1) A la institución de preservación de cepas Obtenga cepas relevantes y seleccione las cepas deseadas.

(2) Recoger muestras de la naturaleza, como suelo, agua, animales y plantas, etc., y separarlas y tamizarlas.

(3) Aislar cepas objetivo de algunos productos fermentados, como aislar bacterias productoras de proteasa de salsa de soja, aislar bacterias productoras de amilasa o glucoamilasa del puré, etc. Este tipo de productos fermentados tiene una larga historia tras una selección natural a largo plazo. Es fácil seleccionar cepas ideales a partir de estos productos tradicionales.

El aislamiento y cribado de cepas bacterianas generalmente se puede dividir en varios pasos: muestreo, enriquecimiento, separación e identificación del producto.

Sección 1 Recogida de muestras microbianas

Las muestras que contienen bacterias son extremadamente abundantes en la naturaleza, siendo el suelo, el agua, el aire, las ramas y hojas muertas, las plantas enfermas, los frutos podridos, etc. todos contienen muchos La cantidad de microorganismos es enorme. Pero en general, las muestras de suelo contienen la mayor cantidad de bacterias.

1. Muestreo del suelo

El suelo es el lugar donde más se concentran los microorganismos porque tiene los nutrientes, el aire y la humedad que requieren los microorganismos. Casi cualquier cepa bacteriana deseada se puede aislar del suelo, y los microorganismos del aire y el agua también se originan en el suelo, por lo que las muestras de suelo suelen ser el objetivo de recolección preferido. En circunstancias normales, el suelo contiene la mayor cantidad de bacterias, y el contenido bacteriano por gramo de suelo generalmente sigue el siguiente patrón decreciente: bacterias (108) > actinomicetos (107) > moho (106) > levadura (105) > algas (104). )>Protozoos (103), donde actinomicetos y mohos se refieren a su número de esporas. Sin embargo, debido a las diferentes características fisiológicas de los distintos microorganismos, su distribución en el suelo también cambia mucho según las condiciones geográficas, los nutrientes, la humedad, la calidad del suelo y las estaciones. Por lo tanto, antes de aislar cepas, se deben recolectar muestras de los entornos y regiones correspondientes según el propósito del aislamiento y la detección.

(1) Según características del suelo

1. Contenido de materia orgánica del suelo y condiciones de aireación

Generalmente, el suelo cultivado, el suelo de huerta y el suelo suburbano son ricos en materia orgánica y tienen suficientes nutrientes. El suelo tiene una estructura granular y una buena aireación y saturación de agua. Los microorganismos crecen vigorosamente y en gran número, especialmente indicado para el crecimiento de bacterias y actinomicetos. El suelo del bosque en la ladera tiene vegetación espesa, muchas hojas caídas, rica materia orgánica, es oscuro y húmedo. Es apto para el crecimiento y reproducción de mohos y levaduras, y la cantidad de microorganismos es relativamente pequeña.

Mirando desde la sección longitudinal de la capa de suelo, la superficie del suelo de 1 a 5 cm tiene una gran cantidad de evaporación, menos agua debido a la luz solar y tiene el efecto de esterilización de los rayos ultravioleta, por lo que el número La cantidad de microorganismos es más pequeña que la de la capa del suelo de 5 a 25 cm. La capa del suelo por debajo de los 25 cm se debe al suelo apretado, al volumen de aire insuficiente, a la falta de nutrientes y humedad, y el contenido bacteriano se reduce gradualmente. Por lo tanto, la mejor capa de suelo para recolectar muestras de suelo es de 5 a 25 cm. Generalmente, cada gramo de suelo contiene de cientos de miles a miles de millones de bacterias, y se pueden aislar casi todos los tipos de bacterias y actinomicetos. Como Bacillus aeróbicos, Pseudomonas, Brevibacterium, Escherichia coli, algunas bacterias anaeróbicas, etc. Pero, en términos generales, la levadura se distribuye en la capa más superficial del suelo, de unos 5 a 10 cm, y los mohos y los bacilos aeróbicos también se distribuyen en la capa poco profunda del suelo.

2. El pH del suelo y el estado de la vegetación

El pH del suelo afectará a la distribución de las especies microbianas. Un ambiente de suelo ligeramente alcalino (pH 7,0-7,5) es adecuado para el crecimiento de bacterias y actinomicetos. Por el contrario, en un ambiente de suelo ácido (por debajo de pH 7,0), el moho y la levadura crecen vigorosamente. Debido a que las secreciones de las raíces de las plantas son diferentes, la vegetación también tiene un cierto impacto en la distribución de los microorganismos. Por ejemplo, hay más bacterias productoras de vitamina C en los campos de tomates o en lugares donde se acumulan tomates podridos.

Cuando madura el fruto de la uva u otros árboles frutales, aumenta la cantidad de levaduras en el suelo cerca de las raíces. Bajo la vegetación de leguminosas, la cantidad de rizobios es más dominante que bajo otra vegetación.

3． Condiciones geográficas

El número y tipos de microorganismos en los suelos del sur son mayores que en los suelos del norte, especialmente en las regiones tropicales y subtropicales. Muchas cepas microbianas industriales, como las bacterias productoras de antibióticos, especialmente mohos y levaduras, proceden principalmente de suelos del sur. La razón es que el sur tiene altas temperaturas, largas estaciones cálidas, abundantes precipitaciones, alta humedad relativa, muchas especies de plantas, una gran cobertura vegetal y un suelo rico en materia orgánica, lo que crea un entorno único para el crecimiento de microorganismos.

4． Condiciones estacionales

La cantidad de microorganismos cambia significativamente en las diferentes estaciones. En invierno, la temperatura es baja y el clima es seco. El crecimiento de microorganismos es lento y el número es el más pequeño. En primavera, a medida que aumenta la temperatura, los microorganismos crecen vigorosamente y su número aumenta gradualmente. Pero en el sur, suele llover mucho en primavera, un alto contenido de humedad del suelo y poca ventilación. Incluso si existe la temperatura y la humedad que necesitan los microorganismos, no favorecen su crecimiento y reproducción. Luego, del verano al otoño, hay alrededor de 7 a 10 meses con temperaturas más altas y una vegetación rica. La cantidad de microorganismos en el suelo es mayor que en cualquier otro momento. Por lo tanto, recolectar muestras de suelo en otoño es lo más ideal.

(2) Método de muestreo

Utilice una pala de muestreo para eliminar unos 5 cm de suelo flotante en la superficie, tome de 10 a 25 muestras de suelo de 5 a 25 lugares y colóquelas en el plástico preparado. Ate la bolsa por dentro. El suelo del norte está seco y se pueden tomar muestras en entre 10 y 30 lugares. Numere las bolsas y registre la ubicación, la textura del suelo, el nombre de la vegetación, la hora del día y otras condiciones ambientales. Generalmente, las muestras deben separarse inmediatamente después de su extracción para evitar la muerte de los microorganismos. Pero a veces hay muchas muestras, o las muestras se toman en otros lugares y el viaje es muy largo, lo que dificulta separarlas a tiempo. Puede utilizar un medio de cultivo selectivo para preparar las pendientes de los tubos de ensayo con anticipación y llevarlas consigo. Vaya a un lugar y mezcle la muestra de suelo tomada y espolvoree de 3 a 4 trozos en la pendiente del tubo de ensayo. Esto puede evitar la muerte de las cepas por no separarse a tiempo.

2. Muestreo según las características fisiológicas de los microorganismos

1. Según el tipo nutricional de los microorganismos

Cada microorganismo tiene diferentes necesidades de fuentes de carbono y nitrógeno, y la distribución también es diferente. Las investigaciones muestran que las necesidades nutricionales y los tipos metabólicos de los microorganismos están estrechamente relacionados con su entorno de crecimiento. Por ejemplo, el suelo del bosque contiene mucha basura y madera podrida, que es rica en celulosa y es adecuada para el crecimiento de bacterias productoras de celulasa que utilizan la celulosa como fuente de carbono, aguas residuales y lodos cerca de plantas procesadoras de carne y zanjas de drenaje de restaurantes. debido a la presencia de una gran cantidad de carroña, frijoles y grasas, las bacterias productoras de proteasas y lipasas se pueden aislar mediante muestreo aquí y es fácil de aislar en plantas procesadoras de harina, fábricas de pastelería, bodegas, plantas procesadoras de almidón y otros lugares para; Cepas que producen proteasa y glucoamilasa. Si desea examinar levaduras que utilizan azúcar como materia prima, normalmente toma muestras de miel, frutas confitadas, frutas dulces y jugos de plantas con altas concentraciones de azúcar. Al examinar las bacterias productoras de pectinasa, dado que las frutas y verduras como los cítricos, las fresas y las patatas contienen mucha pectina, es mejor tomar muestras de las partes podridas de las muestras anteriores y del suelo del huerto. Si es necesario examinar los microorganismos que metabolizan y sintetizan un determinado compuesto, es fácil obtener resultados satisfactorios recogiendo muestras de fábricas cercanas a fábricas que utilizan, producen o procesan este compuesto en grandes cantidades. Las bacterias que utilizan hidrocarburos como fuente de carbono se detectan fácilmente en el suelo cercano a los campos petrolíferos. Hartman et al. aislaron una vez una cepa de Mycobacterium que utilizaba cloruro de etileno como fuente de carbono y fuente de energía cerca de una fábrica de cloruro de etileno. El aire que contiene 1% de cloruro de etileno puede eliminar el 93% de la toxicidad cultivando esta bacteria. Alguien también examinó tres cepas bacterianas que degradan el petróleo de lodos aceitosos que pueden utilizar aceite lubricante mecánico 20# como única fuente de carbono, a saber, Zoogloea sp y Azomonas sp. Por supuesto, una sustancia que necesita ser degradada también puede enriquecerse como única fuente de carbono o nitrógeno para los microorganismos de la muestra, y luego separarse y tamizarse.

Además, muchos microorganismos no son completamente específicos en el uso de fuentes de carbono. Por ejemplo, algunas bacterias productoras de lipasa que utilizan el aceite como fuente de carbono también pueden descomponer el almidón u otras sustancias azucaradas para obtener energía. crecer. Los microorganismos de los yacimientos petrolíferos que utilizan petróleo y otros hidrocarburos como fuentes de carbono también pueden utilizar algunos azúcares como fuentes de carbono. También existen microorganismos con las características anteriores en el suelo, el agua y otras muestras en general. Pero la cantidad es pequeña.

2. Basado en las características fisiológicas de los microorganismos

Al examinar algunos microorganismos con propiedades especiales, es necesario tomar muestras de las ubicaciones correspondientes en función de las características fisiológicas únicas de los microorganismos. Por ejemplo, cuando se examinan bacterias productoras de enzimas de alta temperatura, las muestras generalmente se recolectan del sur, donde la temperatura es más alta, o de aguas termales, erupciones volcánicas y abono en el norte, cuando se aíslan bacterias productoras de enzimas de baja temperatura; se pueden recolectar muestras de lugares fríos, como las regiones árticas y antárticas, sótanos de hielo y mares profundos para aislar bacterias tolerantes a la presión; el muestreo generalmente se realiza en el fondo del océano; Debido a que los microorganismos que viven en las profundidades del mar pueden soportar una alta presión hidrostática, por ejemplo, se examinó del mar una cepa de Micrococcus aquivivus que vive en el agua y que puede crecer a 600 presiones atmosféricas. Al aislar levadura tolerante a alta presión osmótica, dado que prefiere ambientes ácidos y con alto contenido de azúcar, generalmente rara vez se distribuye en el suelo. Por lo tanto, el muestreo generalmente se realiza donde se acumulan frutas dulces, frutas confitadas o bagazo de caña de azúcar. Por ejemplo, una vez alguien aisló una cepa de levadura que puede tolerar un 30% de azúcar y una alta presión osmótica en el néctar.

3. Muestreo en circunstancias especiales

1. Influencia de las condiciones ambientales locales

Vale la pena señalar que la distribución de los microorganismos no solo se ve afectada por sus propias características fisiológicas y factores integrales de las condiciones ambientales, sino también por las condiciones ambientales locales. Por ejemplo, el clima en el norte es frío, la temperatura media anual es baja y hay relativamente pocos microorganismos de alta temperatura. Pero en las aguas termales o en el abono de la zona aparecen numerosos microorganismos de alta temperatura. En teoría, la capa de suelo con suficiente oxígeno solo es adecuada para el crecimiento de bacterias aeróbicas. De hecho, algunas bacterias anaeróbicas también viven. La razón es que el crecimiento y la reproducción de bacterias aeróbicas consumen una gran cantidad de oxígeno en la capa de suelo. ambiente favorable para el crecimiento local de bacterias anaeróbicas. Por lo tanto, las bacterias anaeróbicas también pueden aislarse del suelo.

El océano es un entorno local especial para los microorganismos. Aunque muchos microorganismos también provienen del agua de los ríos, las aguas residuales, la lluvia o el polvo, las condiciones únicas de alta salinidad, alta presión, baja temperatura y luz permiten que los microorganismos marinos. poseer actividades fisiológicas especiales y, en consecuencia, producir algunos productos especiales que son diferentes de las fuentes terrestres. Académicos de la antigua Unión Soviética descubrieron que entre el 20% y el 50% de los microorganismos de las ascidias y los pepinos de mar pueden producir compuestos con toxicidad bacteriana y actividad bactericida. Además, la Universidad de Maryland en Estados Unidos también ha aislado sustancias anticancerígenas contra la leucemia y el cáncer de nasofaringe a partir de bacterias que viven en el cuerpo cavernoso. En Japón, más del 80% de las arqueas amantes de la presión que se encuentran en los intestinos de los peces de aguas profundas pueden producir EPA y DHA, y los rendimientos más altos alcanzan el 36% y el 24%. El autor aisló una cepa de bacteria pj20 del tracto intestinal de bacalao, que produjo 14,78 mg/L de EPA. Cuando se cultivó a 15°C, el EPA representó el 12,7% de los ácidos grasos. Japón también analizó una cepa del Thraustochvtrium aureum marino que producía ADN hasta 290 mg/L. Al tomar muestras del océano, se pueden hacer referencia a los patrones de distribución de diferentes tipos de microorganismos: la capa superficial está formada principalmente por bacterias heterótrofas aeróbicas, la capa inferior es rica en materia orgánica y tiene un alto contenido de sulfuro de hidrógeno, y hay más bacterias anaeróbicas de descomposición. y bacterias reductoras de sulfato. La mayoría de ellas son bacterias de azufre de color púrpura.

Los microorganismos con propiedades especiales suelen distribuirse en algunos ambientes especiales. Por ejemplo, una cueva en el centro-sur de Texas contiene una gran cantidad de microorganismos alcalinos que pueden oxidar el amoníaco y producir quitinasa. La razón es que aquí viven 20 millones de murciélagos, y cada noche comen y pescan 50,000 libras (libras) de insectos. , sus excrementos crean una rica capa de nutrientes a 0 m de profundidad en la cueva. Este entorno especial juega un papel en la selección y el enriquecimiento de este microorganismo. Otros han aislado microorganismos que pueden fijar nitrógeno y degradar la celulosa de los intestinos de un gusano que devora los barcos de madera. También se han aislado bacterias productoras de enzimas descomponedoras de terpenos de los intestinos de los osos koala. Esto puede deberse a que los koalas se especializan en plantas de eucalipto que contienen altos niveles de terpenos, creando un entorno de crecimiento adecuado para este microorganismo. Se aisló una cepa de Arthrobacter de cáscaras de maní tratadas con ácido nítrico en los Estados Unidos. Esta cepa utiliza lignina como única fuente de carbono. Su digestibilidad de las cáscaras de maní tratadas puede alcanzar el 63% y se agrega para aumentar el contenido de proteína. 13,6%, puede utilizarse como aditivo para piensos de ganado vacuno, porcino y pollos.

2． Efectos de condiciones ambientales extremas

Los microorganismos generalmente crecen en condiciones de temperatura moderada y pH neutro. Sin embargo, también hay una pequeña cantidad de microorganismos que existen en ambientes de alta temperatura, baja temperatura, alta acidez, alto contenido de álcali, alto contenido de sal o alta intensidad de radiación donde la mayoría de los microorganismos no pueden crecer. Dichos microorganismos se denominan extremófilos.

El entorno especial en el que viven hace que tengan características genéticas, estructuras especiales y funciones fisiológicas que los diferencian de los microorganismos comunes. Por lo tanto, tienen un gran valor de aplicación en la metalurgia, la minería y la producción de preparaciones enzimáticas especiales.

La temperatura óptima de crecimiento de los termófilos es de 15°C. También pueden crecer y reproducirse a 0°C, y la temperatura máxima no supera los 20°C. Distribuido principalmente en ambientes fríos, como los polos norte y sur, cuevas de hielo, montañas, mares profundos, suelo y otros ambientes de baja temperatura. Este tipo de microorganismos puede producir muchos alimentos aromatizados durante la fermentación a baja temperatura y puede ahorrar energía y reducir la contaminación por bacterias mesófilas. Los microorganismos cuyo pH óptimo de crecimiento es superior a 8,0, normalmente entre pH 9 y 10, se denominan alcalófilos. Se ha aislado una gran cantidad de diferentes tipos de bacterias alcalófilas del suelo, lagos alcalinos, manantiales alcalinos e incluso del océano. Dado que la mayoría de los lagos alcalinos están asociados con una alta salinidad, muchos alcalófilos también son halófilos. Las enzimas producidas por este tipo de bacterias, como la proteasa resistente a los álcalis y la celulasa alcalina, se pueden utilizar como aditivos en detergentes y la amilasa alcalina también se puede utilizar en la industria textil. Los genes de los alcalófilos también se pueden utilizar para regular la expresión y secreción de productos genéticos en otras bacterias. Los microorganismos termófilos son la mejor fuente de bacterias termófilas. Se han aislado bacterias termófilas extremas en aguas termales y cráteres submarinos. Un microorganismo primitivo fue aislado de un cráter volcánico que arrojó gas azufre en Italia. Crece mejor a pH 2 y 90°C. Su tipo metabólico es extremadamente inusual. Puede oxidar el azufre en ácido sulfúrico como bacteria autótrofa. puede multiplicarse y actuar como bacteria anaeróbica para reducir el azufre con hidrógeno y generar H2S