Lo que quieres saber es la electroforesis en gel de agarosa.

El principio de la electroforesis en gel de agarosa tiene las funciones duales de "tamiz molecular" y "electroforesis".

El gel de agarosa tiene una estructura de red, y las moléculas de sustancias encontrarán resistencia cuando pasen, y las moléculas grandes encontrarán una gran resistencia cuando surjan. Por tanto, en la electroforesis en gel, la separación de partículas cargadas depende no sólo de la naturaleza y cantidad de la carga neta, sino también del tamaño de las moléculas, mejorando enormemente la resolución. Sin embargo, debido al gran tamaño de sus poros, su efecto de tamiz molecular es insignificante para la mayoría de las proteínas y ahora se utiliza ampliamente en la investigación de ácidos nucleicos. Las moléculas de ADN tienen efectos de carga y efectos de tamiz molecular cuando nadan en gel de agarosa. Las moléculas de ADN están cargadas negativamente en soluciones de pH por encima del punto isoeléctrico y se mueven hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico. Debido a la estructura repetitiva de la columna vertebral de azúcar-fosfato, la carga neta del mismo número de ADN bicatenario es casi la misma, por lo que pueden moverse hacia el polo positivo a la misma velocidad.

Las moléculas de ácido nucleico son moléculas disociativas anfifílicas. En el tampón de electroforesis por encima de su punto isoeléctrico, sus bases son inseparables y todos los grupos fosfato están disociados, por lo que las moléculas de ácido nucleico están cargadas negativamente y migran hacia el electrodo positivo durante la electroforesis. En otras palabras, hay fosfatos en el ADN, que normalmente están cargados negativamente, por lo que inevitablemente se moverán en dirección positiva.

1. Preparación y preparación del pegamento

Segundo, muestra

1. Ejecuta según la cantidad que desees. Por ejemplo: 10 µl de muestra, 4 y 6 µl de etiqueta, agregar con cuidado al pocillo de muestra con una micropipeta.

Utilice una micropipeta para añadirla con cuidado al tanque de muestra y reemplace la punta después de cada adición de muestra para evitar la contaminación mutua. Tenga cuidado al cargar muestras para evitar dañar el gel o perforarlo en el fondo de la cámara de muestras.

En tercer lugar, electroforesis

1. Después de agregar la muestra, cierre la tapa del tanque de electroforesis y encienda la alimentación inmediatamente. La tensión de control se mantiene a 110 V y la corriente supera los 40 mA. Ejecución de presión lateral

2. Detenga la electroforesis cuando la banda se mueva a unos 2 cm del frente del gel (aproximadamente 40 minutos).

3. Encienda el ordenador y el equipo de observación, tome fotografías y observe bajo luz ultravioleta.

Nota: Los productos de PCR se pueden almacenar en un refrigerador a 4 °C después de su funcionamiento.

Observaciones:

1. Grosor del gel y tamaño de los poros.

En general, los geles más espesos generan más calor durante el funcionamiento, lo que puede provocar que la banda se extienda. Puede producirse una visualización deficiente debido al alto fondo de la tinción en gel o al tiempo necesario para la tinción y/o decoloración del gel (p. ej., tinción post-electroforesis). Para el gel de agarosa, el mejor espesor es de 3 a 4 mm; no se recomiendan geles de más de 5 mm. El espesor del gel de poliacrilamida lo determina el espaciador proporcionado por el fabricante para la infusión del gel. Los más comunes son 0,75 mm, 1,0 mm, 1,5 mm.

La apertura determinada por la forma del peine de goma no solo afecta la carga de la muestra, sino que también afecta la resolución de la tira reactiva. Aunque los agujeros más grandes pueden acomodar volúmenes de muestra más grandes, también producirán franjas más gruesas, lo que reducirá la resolución de las franjas y producirá manchas de color. Sin embargo, un pozo estrecho puede acomodar muestras pequeñas, pero puede proporcionar bandas más nítidas para una mejor resolución. Reducir el volumen de inyección de muestras de alta densidad puede proporcionar bandas de mayor intensidad.

2. Tiempo de electroforesis en ejecución

El tiempo de electroforesis es corto y las bandas de ADN de fragmentos de diferentes longitudes aún no se han separado, y solo la banda principal con mayor contenido de ADN puede hacerlo. ser visto. Sin embargo, el tiempo de electroforesis es largo y las bandas de ADN de fragmentos de diferentes longitudes se han separado y las bandas de ADN de fragmentos de diferentes longitudes se pueden ver claramente.

3. La banda de ADN que se acabó estaba borrosa.