¿Qué efecto tiene el ADN sobre la velocidad de migración en la electroforesis en gel de agarosa?

1. Tamaño molecular y configuración del ADN

El orden de velocidad de movimiento de las diferentes configuraciones del ADN es: ADN de anillo covalentemente cerrado (CCCNA). )>ADN lineal gtADN circular bicatenario abierto. La movilidad de las moléculas lineales de ADN bicatenario en una determinada concentración de gel de agarosa es inversamente proporcional al logaritmo del peso molecular del ADN. Cuanto más grande es la molécula, mayor es la resistencia y más difícil es atravesar los poros del gel.

Por tanto, cuando la concentración de agarosa es demasiado alta, el ADN circular (generalmente esférico) no puede entrar en el gel, y la movilidad relativa es 0 (Rm=0), mientras que el ADN bicatenario lineal del mismo tamaño (Varilla rígida) puede avanzar en la dirección del eje largo (RM >: 0). Se puede ver que la movilidad relativa de estas tres configuraciones depende principalmente de la concentración del gel.

2. Concentración de agarosa

La velocidad de migración de moléculas de ADN lineales de un tamaño determinado en geles de agarosa de diferentes concentraciones es diferente. El logaritmo de la movilidad electroforética del ADN está relacionado linealmente con la concentración del gel. La elección de la concentración del gel depende del tamaño de las moléculas de ADN. La concentración de gel requerida para separar fragmentos de ADN de menos de 0,5 kb es de 1,2 a 1,5, y la concentración de gel requerida para separar moléculas de ADN de más de 10 kb es de 0,3 a 0,5.

3. Conformación de las moléculas de ADN

Cuando la molécula de ADN se encuentra en diferentes conformaciones, la distancia que recorre en el campo eléctrico no sólo está relacionada con el peso molecular, sino también con su propia conformación. Los ADN lineales, circulares abiertos y superenrollados del mismo peso molecular se mueven a diferentes velocidades en geles de agarosa, siendo el ADN superenrollado el que se mueve más rápido.

El ADN lineal de doble cadena es el que se mueve más lentamente. Si resulta difícil determinar si varias bandas de ADN en el gel son causadas por diferentes conformaciones de ADN plasmídico u otro ADN, puede recuperar las bandas de ADN una por una del gel de agarosa, hidrolizarlas con la misma endonucleasa de restricción y luego realizar electroforesis. Si aparece el mismo patrón de ADN en el gel, es el mismo ADN.

4. Voltaje de suministro

Las condiciones experimentales para la separación de macromoléculas de ADN en gel de agarosa muestran que el efecto de separación es mejor a baja concentración y bajo voltaje, y la electroforesis de moléculas de ADN lineales a bajas concentraciones. El bajo voltaje es La movilidad es proporcional al voltaje aplicado.

Sin embargo, a medida que aumenta la intensidad del campo eléctrico, la movilidad de los fragmentos de ADN de diferentes pesos moleculares aumentará en distintos grados. Cuanto más grande es el fragmento, mayor es el aumento de la movilidad causado por el aumento de la intensidad del campo eléctrico, por lo que el rango de separación efectivo del gel de agarosa disminuye al aumentar el voltaje. Para lograr la máxima resolución de fragmentos de ADN de más de 2 kb, la intensidad del campo eléctrico no debe ser superior a 5 V/cm.

5. Presencia de colorante intercalante

El colorante fluorescente bromuro de etidio se utiliza para detectar ADN en geles de agarosa. El tinte se incrustará entre pares de bases apiladas y estirará el ADN circular largo y espaciado, haciéndolo más rígido y reduciendo la movilidad lineal del ADN.

6. Efecto de la fuerza iónica

La composición del tampón de electroforesis y su fuerza iónica afectan a la movilidad electroforética del ADN. Cuando no hay iones (por ejemplo, si se utiliza agua destilada para preparar el gel), la conductividad es mínima y el ADN apenas se mueve. En tampones con alta fuerza iónica (como la adición accidental de tampón de electroforesis 10X), la conductividad es muy alta y el calor es evidente. En casos graves, puede provocar la fusión del gel o la desnaturalización del ADN. Para el ADN bicatenario natural, se utilizan habitualmente varios tampones de electroforesis, como TAE [que contiene EDTA (pH 8,0) y ácido trisacético], TBE (ácido trisbórico y EDTA), TPE (Trisfosfato y EDTA). , generalmente formulado como Concentrar las aguas madres y almacenar a temperatura ambiente.