¿Cuál es el principio de la electroforesis en gel de agarosa?
La agarosa es un polímero lineal que contiene d? - y la l-galactosa están conectadas a través de enlaces α(1-3) y β(1-4), con un puente de deshidratación entre las posiciones 3-6. Gelifica en tamaños que van desde 50 hasta ≥ 200? Cuadrícula de canales tridimensionales a nanoescala. La movilidad de una muestra de ADN depende de varios factores mencionados en el capítulo anterior. Un factor es el tamaño de la muestra de ADN.
La electroforesis en gel de agarosa es uno de los dos componentes principales de la agarosa y se utiliza en bioquímica, biología molecular, genética y química clínica para poblaciones mixtas de moléculas grandes como ADN o proteínas. Las proteínas se pueden separar por carga y/o tamaño (la electroforesis en agarosa con enfoque isoeléctrico es esencialmente independiente del tamaño), mientras que los fragmentos de ADN y ARN se pueden separar por longitud.
La separación de biomoléculas mediante la aplicación de un campo eléctrico hace que las moléculas cargadas pasen a través de la matriz de agarosa, y las biomoléculas se separan según su tamaño en la matriz del gel de agarosa.
El gel de agarosa es fácil de moldear y tiene relativamente pocos grupos cargados, lo que lo hace especialmente adecuado para separar ADN en los rangos de tamaño más habituales en el laboratorio, por lo que se utiliza mucho. El ADN aislado se puede visualizar con tintes y, más comúnmente, los fragmentos de ADN se pueden extraer del gel con relativa facilidad bajo luz ultravioleta. La mayoría de los geles de agarosa utilizados se disuelven en 0,7-2% de un tampón de funcionamiento adecuado.
Características
Vierta el gel de agarosa en el plato para electroforesis en gel. El gel de agarosa es una matriz tridimensional compuesta de moléculas de agarosa helicoidales en haces superhelicoidales con canales y poros a través de los cuales pueden pasar las biomoléculas. ?
La estructura tridimensional se mantiene unida mediante enlaces de hidrógeno, por lo que puede destruirse calentándola de nuevo al estado líquido. La temperatura de fusión es diferente de la temperatura del gel. Dependiendo de la fuente, el gel de agarosa tiene una temperatura de gel de 35-42°C y una temperatura de fusión de 85-95°C. También se encuentran disponibles agarosa de bajo punto de fusión y de bajo gel elaboradas mediante modificación química.
El gel de agarosa tiene un tamaño de poro grande y una buena resistencia del gel, y es adecuado como medio de convección para la electroforesis de ADN y moléculas de proteínas grandes. Se estima que el tamaño de poro de un gel al 1 % es de 100 nm a 200-500 nm, y su resistencia del gel permite diluirlo al 0,15 % para formar una placa de electroforesis en gel.
Sin embargo, los geles de baja concentración (0,1-0,2%) son quebradizos y, por tanto, difíciles de manipular. Los geles de agarosa tienen una resolución de ADN más baja que los geles de poliacrilamida, pero tienen un rango de separación más amplio y, por lo tanto, se utilizan para fragmentos de ADN de 50 a 20 000 BP de tamaño.
También se puede utilizar para la separación de proteínas y es el sustrato preferido para la electroforesis en gel de partículas con un radio efectivo superior a 5-10 nm. El gel de agarosa al 0,9% tiene suficientes poros para que entre el fago T4.
Los polímeros de agarosa contienen grupos cargados, especialmente piruvato y ácido sulfúrico. ? Estos grupos cargados negativamente crean un flujo de agua en la dirección opuesta al movimiento del ADN en un proceso llamado electroósmosis (EEO), por lo que pueden retrasar el movimiento del ADN y provocar bandas borrosas. Los geles con concentraciones más altas tendrán un flujo electroosmótico más alto.