Mapa del genoma: mapa genético y mapa físico

Los mapas genéticos se inventaron con el descubrimiento del enlace parcial de los cromosomas.

Hay muchos genes en un cromosoma. Los cromosomas homólogos se separan durante la meiosis. Lo ideal es que los genes de un cromosoma se distribuyan juntos a los gametos, pero este no es el caso. Debido a que las cromátidas se romperán y se intercambiarán fragmentos de ADN durante la primera división de la meiosis, se producirá un enlace parcial de los cromosomas. Antes de la invención de la secuenciación, el enlace genético o el enlace parcial se determinaba mediante observación fenotípica.

Para algunos vínculos, las personas descubrieron tempranamente a través de fenotipos que existen diferencias en la frecuencia de aparición de vínculos entre diferentes genes. Así, el alumno de Morgan, Arthur Sturtevant, planteó la hipótesis de que el intercambio de cromátidas en un sitio específico era un evento aleatorio, y que la probabilidad de que ocurriera el intercambio en cualquier posición de un par de cromátidas yuxtapuestas era la misma. Según el supuesto anterior, la probabilidad de que dos genes adyacentes se separen debido al intercambio será menor que la de dos genes que estén más separados (porque es más probable que los genes adyacentes permanezcan juntos incluso si se intercambian). Además, la probabilidad de perder el vínculo entre genes debido al cruce es proporcional a su distancia en el cromosoma. Por tanto, la frecuencia de recombinación se puede utilizar para medir la distancia entre dos genes. Al calcular la frecuencia de recombinación entre diferentes pares de genes, se puede construir un mapa que muestra las posiciones relativas de los genes en un cromosoma (un mapa genético).

Desventajas de los mapas genéticos: La resolución de los mapas genéticos depende del número de cruces obtenidos. Para los humanos y para la mayoría de los eucariotas superiores, es imposible obtener una gran cantidad de descendencia debido a los estudios genéticos. Los mapas genéticos tienen una precisión limitada. La hipótesis de Sturtevant afirma que los intercambios se producen de forma aleatoria en las cromátidas, pero esta hipótesis no es del todo correcta debido a la existencia de puntos críticos de recombinación. Para obtener un mapa del genoma más preciso, se inventaron métodos de dibujo de mapas físicos. Los más importantes son: mapeo de restricción, hibridación fluorescente in situ (FISH) y mapeo de sitios etiquetados con secuencia (STS).

La idea básica de este método es comparar el tamaño de los fragmentos producidos por la escisión de una molécula de ADN mediante dos enzimas de restricción que reconocen diferentes secuencias diana. Los productos de la escisión pueden detectarse mediante electroforesis (Figura). 1). Para fragmentos cuya secuencia no se puede determinar, se puede utilizar restricción parcial para generar un conjunto de productos parcialmente digeridos para analizar el posible ordenamiento de los fragmentos. También existe un método mejorado (Figura 2), que consiste en agregar etiquetas radiactivas o de otro tipo a ambos extremos de las moléculas de ADN que se van a analizar antes de la digestión parcial, de modo que los fragmentos visibles escindidos por enzimas se puedan clasificar bajo la guía de fluorescencia, simplificando el proceso de digestión parcial. Proceso de detección de última generación.

La escala del mapeo de restricción está limitada por el tamaño del fragmento de restricción. Debido a que los sitios de restricción son numerosos y densos en la secuencia de ADN, los productos de la digestión se superponen o divergen en el gel de agarosa. Por lo tanto, el mapeo de restricciones es más adecuado para moléculas pequeñas. Por supuesto, también se puede confiar en determinadas "enzimas raras" de corte para obtener un menor número de fragmentos. Por ejemplo, puede reconocer específicamente Sap I y Sgf I de 7 u 8 nucleótidos. Para una molécula de ADN con un contenido de GC de 50, estas enzimas 7-nucleotidasas tienen un punto de corte promedio cada 4^7 = 16384 pb. Además de las "enzimas raras", también existen ciertas secuencias específicas que rara vez se encuentran en el genoma humano. Se pueden obtener resultados similares cortando con endonucleasas de restricción correspondientes a dichas secuencias.

Debido al uso de "enzimas raras" para producir fragmentos de secuencias largas, la electroforesis ordinaria no es capaz de separarlos, porque los fragmentos largos se entrelazan fácilmente y las interacciones intermoleculares son más frecuentes.

Para ello, se debe utilizar un campo eléctrico más complejo en lugar del campo eléctrico lineal ordinario. Por ejemplo, electroforesis en gel de alternancia de campos ortogonales (OFAGE), etc.

Además de la electroforesis, también se pueden utilizar otros métodos para mapear los sitios de restricción de las moléculas de ADN. Los sitios de corte de las enzimas de restricción se pueden detectar mediante observación directa bajo un microscopio. Esta técnica se denomina mapeo óptico. Dos métodos comúnmente utilizados son el estiramiento del gel y el peinado molecular (Figura 3). Las fibras de ADN preparadas se tiñen con tintes fluorescentes y luego se cortan con enzimas de restricción. Las posiciones relativas de los cortes se pueden observar a través de un microscopio de fluorescencia.

Al igual que el mapeo óptico, FISH puede mostrar directamente la ubicación de secuencias marcadoras en cromosomas o moléculas de ADN estiradas. En FISH, un marcador es una secuencia de ADN que se visualiza hibridando con una sonda fluorescente. Al aplicar este método, es necesario abrir el par de bases que mantiene la estructura de doble hélice del ADN cromosómico para que pueda formar una molécula monocatenaria (es decir, el ADN se "desnaturaliza"). . Un método estándar para desnaturalizar el ADN cromosómico sin destruir su morfología es secar los cromosomas en un portaobjetos de vidrio y luego tratarlos con formamida.

Si la sonda es un fragmento de ADN largo, puede haber algunas secuencias de ADN repetitivas (repeticiones en tándem o no en tándem espaciadas en la secuencia de ADN), por lo que la sonda puede interactuar con múltiples ubicaciones en el cromosoma. La hibridación de puntos ocurre no solo en su sitio específico coincidente exacto. Para reducir esta hibridación no específica, la sonda se mezcla con ADN no marcado del tejido en estudio antes de su uso y se añade un fragmento rico en secuencias repetidas para bloquear las secuencias repetidas en la sonda. De esta manera, la reacción de hibridación in situ está completamente impulsada por una única secuencia.

Un experimento FISH solo puede obtener no más de 3 o 4 sitios de mapas etiquetados, y la acumulación de datos es lenta y requiere mucho tiempo. Por lo tanto, hacer realidad los mapas físicos detallados requiere tecnologías más eficientes. Actualmente, la tecnología de mapeo más eficaz y la que produce mapas más detallados de genomas grandes es el mapeo STS. Un sitio de etiqueta de secuencia (STS) es una secuencia de ADN corta, generalmente de 100 a 500 pb, que es fácilmente identificable y ocurre solo una vez en el cromosoma que se va a estudiar. Para completar un mapa STS es necesario recolectar fragmentos de ADN superpuestos de un solo cromosoma o de un cromosoma o genoma completo.

El principio básico se muestra en la siguiente figura (Figura 5). Al recopilar los datos necesarios para el mapeo, cada STS debe estar alineado para comprender qué segmentos contienen qué STS. Esto se puede hacer mediante análisis de hibridación, pero normalmente se utiliza la PCR porque es más rápida. El método específico consiste en fragmentar aleatoriamente el ADN utilizado en el estudio (se requieren seis conjuntos de fragmentos de ADN consistentes para la fragmentación) y luego usar un solo STS para detectar los fragmentos de ADN donde se encuentran. El STS se sintetiza artificialmente y tiene un. etiqueta fluorescente y se detecta mediante PCR. Se extiende en fragmentos que contienen pares STS. Si dos STS están lo suficientemente cerca, la probabilidad de que aparezcan en el mismo fragmento será mayor y se pueden observar dos marcadores con intervalos consistentes en múltiples fragmentos mediante microscopía de fluorescencia. Por el contrario, cuanto más alejados estén dos marcadores, menor será la probabilidad de que estén situados en el mismo segmento. De hecho, de manera similar a la forma en que el análisis de vinculación calcula la distancia de la imagen, la distancia de la imagen STS se calcula en función de la frecuencia de separación, en lugar de la distancia de la imagen observada, porque los marcadores con distancias similares utilizan la presencia o ausencia de señales para realizar una discriminación de frecuencia basada. en observaciones a mayor distancia. Más fácil y más preciso. En base a esto, se completó el mapa físico con STS como símbolo físico.

El proceso anterior deja dos preguntas que necesitan explicación adicional.

Lo primero es la elección del STS. Cualquier secuencia de ADN única se puede utilizar como STS, pero se deben cumplir dos condiciones. En primer lugar, se debe conocer su secuencia para poder detectar mediante PCR la presencia o ausencia del STS en diferentes fragmentos de ADN. En segundo lugar, el STS debe tener una ubicación única en el cromosoma a estudiar. Si hay múltiples copias, la distancia física entre los marcadores no se obtendrá con precisión.

El segundo trata sobre fragmentos de ADN para mapeo STS. Una fuente son las bibliotecas construidas mediante interrupción aleatoria, como se mencionó anteriormente. Actualmente existen dos métodos comúnmente utilizados para interrumpir el ADN completo: la disrupción ultrasónica y la disrupción enzimática. Los instrumentos comúnmente utilizados para la disrupción ultrasónica son la serie Covaris y las enzimas de fragmentación se pueden usar para la disrupción enzimática. Este fragmento de secuencia interrumpido aleatoriamente tiene regiones superpuestas y puede formar un contig de clon, cumpliendo así las condiciones para construir una biblioteca de clones. Simplemente clone fragmentos aleatorios en vectores apropiados para crear una colección de múltiples bibliotecas de clones (inicialmente hay varias bibliotecas de clones para varios conjuntos de ADN). Por otro lado, si tiene bibliotecas de clones de ADN objetivo, también pueden usarse para análisis STS de la misma manera que respaldan el trabajo de secuenciación. La segunda fuente son los híbridos de radiación, que son células de roedores que contienen fragmentos de cromosomas de otros organismos. Esta tecnología se desarrolló por primera vez en la década de 1970, cuando se descubrió que la exposición de células humanas a rayos X en dosis de 3.000 a 8.000 rads provocaba que los cromosomas se rompieran aleatoriamente en fragmentos. Cuanto mayor era la dosis de radiación, más pequeños eran los fragmentos producidos. Este tratamiento es letal para las células humanas, pero si las células irradiadas con aquenio se fusionan con células de hámster u otros roedores no irradiadas, los fragmentos cromosómicos pueden transferirse a estas últimas. La fusión de las dos células puede promoverse mediante el tratamiento con agentes químicos como el polietilenglicol o mediante la exposición al virus Sendai. Este método proporciona los fragmentos de ADN necesarios para el mapeo STS y jugó un papel importante en la etapa de mapeo del Proyecto Genoma Humano. Pero los temas parecen centrarse en los animales.

En resumen, existen varios métodos para dibujar mapas del genoma. Se puede decir que la información del ADN que pueden reflejar varios mapas es diferente y cada uno tiene su propia singularidad. Por ejemplo, el mapa STS es el más preciso, pero puede que no incluya todos los sitios de restricción y los fragmentos de ADN que localiza no son específicos. El mapa de restricción puede calibrar con precisión sitios de restricción útiles, aunque requiere una gran cantidad de calibración de secuencia. Los fragmentos son más difíciles. Además, el patrón obtenido mediante hibridación fluorescente in situ es más intuitivo y específico que el mapeo STS, y la operación no es complicada. En comparación con los mapas físicos, los mapas genéticos aparecieron antes y su precisión y resolución no son altas. Sin embargo, sus ideas de dibujo proporcionan ideas para el mapeo STS, es decir, basándose en la recesividad de los fenotipos o la presencia o ausencia de señales, calculan la frecuencia y. dibuja el mapa.

¿Para qué sirve el mapeo genómico? Es posible que esto no haya estado claro en las primeras etapas de la invención de las tecnologías antes mencionadas. Pero con la introducción de la secuenciación del ADN, y cuando el concepto ya no estaba fuera de alcance, la gente se dio cuenta de que los mapas del genoma podían proporcionar un marco para la secuenciación. Esto se debe a que el genoma completo de los eucariotas superiores a menudo contiene una gran cantidad de regiones repetitivas, y el simple empalme de regiones superpuestas provocará una desalineación en estas regiones. Por lo tanto, en el mapa dibujado de antemano, se pueden descubrir varios marcadores que cubren todo el genoma, ya sean genes, sitios de restricción, sitios STS, etc., y se pueden corregir errores. El mapa del genoma puede proporcionar un gran recurso para el posterior empalme y empalme del genoma. Montaje conveniente. Además, la combinación de los resultados de la secuenciación con mapas del genoma puede localizar genes y otras características significativas en las secuencias de ADN para investigaciones posteriores en diversos aspectos, como la digestión con enzimas de restricción, el análisis funcional y el diagnóstico genético. La acumulación de resultados de investigaciones iniciales en diferentes sitios de secuencia y la adquisición de secuencias genómicas completas de especies modelo de diferentes taxones y especies relacionadas después del desarrollo de la tecnología de secuenciación nos han permitido dominar una gran cantidad de información sobre el genoma y el transcriptoma.

Dado que los mapas del genoma pueden proporcionar una referencia para el empalme y ensamblaje de secuencias medidas, ¿es el mapeo un requisito previo necesario para la secuenciación? Con respecto a esta pregunta, sería más apropiado responderla después de actualizar el capítulo relacionado con la secuenciación. Sin embargo, hasta donde se sabe, la secuenciación de genomas pequeños, como las bacterias, se puede unir completamente mediante el método de escopeta sin necesidad de corrección del mapa.

[1] T. A. Brown. Genome 3[M]. Primera edición. Beijing: Science Press, 2009.

[2] Tian Yu. Análisis de hibridación in situ por fluorescencia cromosómica[D]. Southwest University, 2021. DOI: 10.27684/d.cnki.gxndx.2021.002123.