¿Qué es el VHB?
El virus de la hepatitis B (VHB) es un virus de ADN. Al igual que cierto tipo de veneno secretado por serpientes venenosas solo afecta partes específicas del cuerpo, el VHB solo tiene un gusto especial por el hígado. Es un miembro de la familia hepadnavividae en biología. Los virus de esta familia también se encuentran en mamíferos y aves. Sus estructuras, secuencias genéticas y estrategias de replicación son muy similares, pero no se cruzan entre sí. Además de apuntar a órganos específicos, también tienen "requisitos raciales" para sus huéspedes. Por ejemplo, el VHB sólo es susceptible a los humanos y a los orangutanes.
Una partícula completa del virus de la hepatitis B, también llamada partícula Dane, tiene sólo 42 nanómetros de diámetro, aproximadamente una millonésima parte del tamaño de un huevo común. El virus de la hepatitis B tiene una cubierta y un núcleo. Es decir, además de la hermosa "cubierta" que tienen la mayoría de los virus, el virus de la hepatitis B también necesita una "cubierta" sofisticada. La capa es la llamada "capa", que tiene entre 7 y 8 nanómetros de espesor y está formada por una bicapa lipídica y una proteína. La bicapa lipídica contiene el antígeno S, los antígenos pre-S1 y pre-S2, que juntos constituyen las tres formas proteicas dentro de la cubierta, a saber, el antígeno de superficie de la hepatitis B (HbsAg), comúnmente conocido como anticuerpo australiano. También hay una historia sobre el origen de la resistencia a los antibióticos en Australia, que se aisló por primera vez del suero de los aborígenes australianos. En ese momento, se consideraba un marcador genético exclusivo de la población local, por lo que se le llamó "antígeno australiano". Más tarde descubrí que era el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. El llamado antígeno es en realidad un elemento que hace que el cuerpo produzca resistencia. Por el contrario, el elemento que puede reconocer y resistir el antígeno en el cuerpo es un anticuerpo.
Retire la capa exterior de las partículas de Dano para revelar las partículas centrales del virus de la hepatitis B. La partícula central tiene un diámetro de 28 nm y es icosaédrica. Su superficie es la verdadera cápside del virus, que está compuesta por el antígeno central del virus de la hepatitis B (HBcAg). Se observaron nucleocápsides libres sólo en los núcleos de los hepatocitos. El otro antígeno importante del VHB, el antígeno e, puede quedar expuesto mediante un tratamiento enzimático o con un detergente fuerte. Su naturaleza no está del todo clara, pero la mayoría la considera la pieza central.
La parte central de la partícula de Dano es una doble cadena de ADN con un espacio circular y una ADN polimerasa unida a ella. Una de las características más llamativas del genoma del VHB es que es muy pequeño. Su molécula de ADN contiene alrededor de 3.200 nucleótidos, cientos de veces más pequeña que el genoma viral más grande conocido y sólo una millonésima parte del tamaño del genoma que poseen los humanos. Además, las dos cadenas de ADN del VHB tienen diferente longitud. La cadena larga está completa y la longitud es constante, lo cual es negativo. La cadena corta es una cadena positiva de longitud variable, entre 50 y 80 veces más larga que la cadena larga. Tanto los antígenos de superficie como los centrales están codificados por el ADN de las partículas Dane.
De hecho, al microscopio electrónico se pueden observar tres formas diferentes del virus de la hepatitis B: partículas esféricas grandes, partículas esféricas pequeñas y partículas tubulares. Las partículas esféricas grandes son partículas de Dano. Las partículas pequeñas esféricas con un diámetro de unos 22 nanómetros son las más comunes en la sangre después de la infección por el virus de la hepatitis B. Consiste en antígenos de superficie y no contiene ADN del virus de la hepatitis B ni ADN polimerasa. Las partículas tubulares también tienen unos 22 nanómetros de diámetro y 50-70 nanómetros de longitud. En realidad, está compuesto por varias partículas esféricas pequeñas, pero también tiene la antigenicidad del HBsAg. Ya sean partículas o partículas tubulares, no son partículas completas del virus de la hepatitis B, sino cápsulas excesivas sintetizadas cuando el virus de la hepatitis B infecta las células del hígado y están libres en la circulación sanguínea humana.
(2) Preparación de la vacuna contra la hepatitis B
Parte 1: Introducción al virus de la hepatitis B
El virus de la hepatitis B (VHB) provoca inflamación del hígado. El virus se puede identificar con una lupa por sus "partículas danesas" redondas e infecciosas y su envoltura viral tubular y vacía. Las manifestaciones de la enfermedad incluyen ictericia y enfermedades similares a la gripe, mientras que la infección crónica puede provocar cambios patológicos graves como cirrosis y cáncer de hígado.
Parte 2: Tratamiento y prevención de la hepatitis B
El virus de la hepatitis B también puede transcribir ARN en ADN, pero este virus empaqueta la versión de ADN de su genoma en partículas virales. A diferencia de los retrovirus, el virus de la hepatitis B no se integra en el ADN de la célula huésped.
Mientras los investigadores trabajan en nuevos tratamientos prometedores para la hepatitis B, los únicos disponibles actualmente son los interferones, que sólo son eficaces en pacientes de 35 a 40 años.
Actualmente no existe un método antiviral eficaz para tratar la infección crónica por el virus de la hepatitis B, pero tanto la vacuna transmitida por la sangre como la vacuna recombinante pueden prevenir eficazmente la infección viral. Por lo tanto, el desarrollo y la producción de vacunas se han convertido en una cuestión importante. factor en la prevención y el tratamiento de esta enfermedad. Un arma importante para los virus.
La vacuna contra la hepatitis B transmitida por la sangre se prepara a partir de plasma que contiene el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). En 1976, Maupas et al. descubrieron por primera vez que las partículas de antígeno de superficie aisladas del suero de portadores del VHB pueden estimular al cuerpo para que produzca anticuerpos anti-HBsAg (HBsAb), que pueden neutralizar el virus de la hepatitis B y prevenir eficazmente la infección por VHB. El contenido de partículas de antígeno de superficie del virus de la hepatitis B en el suero de los portadores puede ser muy alto, por lo que puede usarse para preparar vacunas. Esta es una vacuna de transmisión sanguínea y la vacuna contra la hepatitis B de primera generación. El antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) es la proteína de la membrana externa del VHB y está codificado por la región S del genoma del VHB. La región S se divide en tres segmentos: genes pre-S1, pre-S2 y S. Sus marcos de lectura están en fase, dispuestos en serie y se puede utilizar un código de parada. Estos tres genes codifican la proteína preS1, preS2 y s respectivamente. La región s incluye muchos epítopos de células B y T que desempeñan un papel importante en la respuesta inmune contra el VHB. Al mismo tiempo, la proteína S desempeña un papel importante en la infección por VHB y en el ensamblaje del virión del VHB. Toda la información para la formación y secreción de partículas de HBsAg se encuentra en la proteína S. En el extremo N de la región preSl existe una señal de retención que puede antagonizar la señal de secreción de la proteína S. 1.2 Inmunogenicidad del VHB.
La investigación ha confirmado que la vacunación con proteína S, concretamente la proteína Bag, puede prevenir y tratar eficazmente la hepatitis B. Kehenning et al construyeron un plásmido de expresión (PS) para el antígeno S del virus de la hepatitis B y confirmaron que PS expresa. AgHBs in vitro. Después de inmunizar ratones BALB/c respectivamente, se descubrió que la PS puede inducir eficazmente inmunidad humoral en ratones. Al mismo tiempo, el péptido codificado por la región pre-S2 de la proteína M también tiene una alta inmunogenicidad, lo que puede superar el fenómeno de falta de respuesta inmune al HBsAg cuando se usa junto con la proteína S como vacuna. Algunos estudiosos creen que la proteína L de longitud completa tiene una mayor inmunogenicidad.
La prevención y el tratamiento de la hepatitis B es principalmente un proceso inmunopatológico. La respuesta inmune del cuerpo al polipéptido preS es de gran importancia para bloquear la reinfección por el VHB. La inmunidad humoral y la inmunidad celular contra los péptidos preS también juegan un papel muy importante en la eliminación del virus y la promoción de la recuperación del cuerpo.
Aunque la vacuna contra la hepatitis B transmitida por la sangre tiene un buen efecto protector, se prepara a partir del plasma del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). En teoría, su seguridad no puede cumplir con el requisito del 100% y existe un peligro potencial. Con el desarrollo de la ingeniería genética, la vacuna contra la hepatitis B de segunda generación, la vacuna genéticamente modificada, ha logrado un gran éxito, y también ha avanzado la investigación sobre las vacunas contra la hepatitis B con péptidos sintéticos y las vacunas de ADN contra la hepatitis B. Este tipo de vacuna peptídica o subunitaria tiene grandes ventajas en términos de producción, calidad, inmunogenicidad y seguridad, y está reemplazando gradualmente a las vacunas derivadas de la sangre.
Las vacunas genéticamente modificadas, también conocidas como vacunas genéticamente recombinantes, están diseñadas para clonar genes que codifican antígenos en vectores de expresión e inyectar ADN plasmídico recombinante directamente en los animales para que los antígenos correspondientes se expresen en los animales y el cuerpo los produzca. vacunas dirigidas. respuesta inmune al antígeno. Esta es la tecnología de inmunización con ácido nucleico o vacuna de ADN. El resultado de la inmunización con ADN no es sólo la producción de los anticuerpos correspondientes, sino también la producción de respuestas inmunitarias celulares específicas, lo que es de gran importancia para resistir la infección por VHB.
A través de la inspección, se demostró que la inmunogenicidad de las vacunas genéticamente modificadas es la misma que la de las vacunas de origen sanguíneo, y que no existe ningún peligro potencial causado por las materias primas de origen sanguíneo (existe el riesgo de transmisión sanguínea de enfermedades como la hepatitis B, la hepatitis C y el SIDA).
Al principio, se estudió el uso del sistema de expresión procariótica de E. coli para producir vacunas genéticamente modificadas contra la hepatitis B, pero fracasaron debido a los bajos niveles de expresión y los productos inestables. Los primeros éxitos fueron con la levadura. Valenzuela et al. expresaron con éxito el HBsAg en S. cerevisiae colocando el gen HBsAg del subtipo adw bajo el control del promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH) de levadura.
Posteriormente, los investigadores científicos hicieron lo mismo y desarrollaron vacunas contra la hepatitis B genéticamente expresadas con levadura que podrían ingresar al mercado. En los últimos años, los sistemas de expresión de levaduras se han optimizado continuamente. Zhang Wei et al. amplificaron fragmentos de ADNc de diferentes tamaños que contenían la región pre-S del VHB mediante PCR, los clonaron en el plásmido pUC19 y luego los clonaron en el vector cebo de dos híbridos de levadura pGBKT7. El plásmido recombinante se introdujo en la levadura AH109 para su expresión y se detectó su producto de expresión, lo que demostró que tenía un efecto activador sobre la levadura AH109 y el gen indicador. Vassileva et al. [5i] utilizaron el promotor gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) para realizar la expresión del gen HBsAg en Pichia pastoris. Bajo la acción del promotor GAP, el huevo antigénico se puede expresar continuamente y los experimentos ELISA muestran que el producto de expresión tiene una inmunogenicidad eficaz. Esta investigación promueve aún más el desarrollo de sistemas de expresión de levaduras.
Las ventajas del sistema de expresión de levadura son: ① El sistema es simple, la producción es fácil de controlar y la salida es estable; ② Alto nivel de expresión ③ El producto de expresión HBsAg se puede ensamblar en la superficie; partículas de antígeno, y la inmunogenicidad de las partículas es mejor que la del HBsAg monomérico. Más de 1.000 veces más fuerte, esta es la clave para que el producto de expresión se convierta en una vacuna. Sin embargo, este sistema también tiene algunas desventajas, por ejemplo, el HBsAg expresado por la levadura no puede secretarse, lo que trae más dificultades para el aislamiento y la purificación del producto. La glicosilación excesiva del HBsAg expresado por la levadura en el sistema de levadura no sólo empeora la estabilidad de la misma. el producto, pero también afecta la inmunogenicidad.
(3) Producción y mecanismo de los anticuerpos contra la hepatitis B
El proceso de producción de anticuerpos es aproximadamente el siguiente: después de que el antígeno ingresa a las células, aumenta el número de folículos linfoides y centros germinales. . Estas regiones son linfocitos B especializados con diferentes etapas de diferenciación en respuesta al antígeno. Bajo estimulación antigénica, el citoplasma de estas células contiene abundantes multímeros y aumenta el retículo endoplásmico rugoso. Parte de las células B estimuladas se diferencian en células plasmáticas, sintetizan globulina secretora y contienen abundante retículo endoplasmático rugoso y cuerpos gaussianos bien desarrollados. A medida que la molécula de inmunoglobulina pasa a través del cuerpo gaussiano antes de la secreción, los residuos de azúcar se unen a la cadena H. La respuesta de anticuerpos producida en este momento no produce una gran cantidad de anticuerpos. Entre ellos, las células B todavía están dominadas por la IgM, y el aumento en el número de células B muestra claramente moléculas de inmunoglobulina en las superficies de sus membranas celulares. Cuando se estimulan con antígeno por segunda vez, las células B se activan rápidamente y responden a una gran cantidad de antígenos existentes, por lo que la globulina del anticuerpo 7S específico en el suero aumenta rápidamente.
El mecanismo inmunológico importante para eliminar el VHB es la respuesta inmune celular específica del VHB en la etapa temprana de la infección que inicia el proceso de eliminación del VHB. El efecto inmunológico importante del cuerpo es la respuesta no mediada por citocinas. Mecanismo de daño a los hepatocitos para eliminar el VHB. El daño hepatocelular no necesariamente ocurre durante la eliminación del VHB. Los hepatocitos pueden producir IFN y otras citoquinas bajo ciertas condiciones, y eliminar directa y activamente el VHB a través de los mecanismos anteriores.
En primer lugar, la respuesta inmune celular específica del VHB en la etapa temprana de la infección por el virus VHB es un factor clave para que el cuerpo inicie el proceso de eliminación del virus VHB. La respuesta inmune específica contra el VHB inducida en pacientes con infección aguda por VHB es una fuerte respuesta inmune celular policlonal, multiespecífica, y el virus finalmente se elimina; sin embargo, en pacientes con infección crónica por VHB, la inmunidad celular específica contra el VHB es débil; y el cuerpo se vuelve inmune al VHB. Los CTL sensibilizados extrahepáticamente en sangre periférica en la etapa temprana de la infección por VHB pueden producir IFN2γ, TNFα y otras citocinas. A medida que fluye con sangre a través de las células endoteliales sinusoidales del hígado, el CTL se activa aún más y libera más citocinas. Además, los antígenos del VHB en la superficie de los hepatocitos pueden activar aún más los CTL específicos del VHB y liberar citocinas nuevamente. Los CTL específicos activan continuamente la proliferación 1 y liberan continuamente grandes cantidades de citoquinas. Además, las citocinas producidas por los CTL activados también pueden activar células inmunes no específicas en el hígado, como las células NK intrahepáticas y las células NK2T, a través de los poros entre las células endoteliales sinusoidales del hígado, produciendo grandes cantidades de IFN2γ, TNFα y otros. citocinas. Inhibe la replicación del VHB para la amplificación inmune. Por lo tanto, una vez que el CTL se activa mediante la estimulación del antígeno del VHB, iniciará una reacción en cascada, amplificará la señal de estimulación, activará más efectos anti-VHB y, en última instancia, logrará el propósito de eliminar el VHB.
Por tanto, la inmunidad celular específica en las primeras etapas de la infección por VHB estimula el mecanismo de eliminación no lítica del VHB, que es la clave para iniciar el proceso de eliminación del VHB.
La segunda es que las citocinas como IFN2γ y TNFα actúan sobre los receptores de la superficie de las células hepáticas para eliminar el VHB. Los CTL específicos y las células inmunes no específicas desempeñan el mismo papel, logrando así la etapa temprana aguda de la hepatitis B contra. virus celulares insolubles de aclaramiento. Su * * * misma manera efectiva es producir citocinas efectivas, como IFN2γ y TNFα, que actúan sobre las células del hígado a través de citocinas, eliminando así el VHB. Uno de los mecanismos antivirales conocidos del interferón es inducir a las células diana a sintetizar proteínas antivirales (AVP), como la proteína quinasa (PKR), la 225A sintetasa PRNasa L, la proteína Mx, etc., uniéndose a los receptores correspondientes en la superficie de células diana. Se descubrió que el IFN2α induce la producción de la proteína MxA en células de cáncer de hígado transfectadas con VHB e inhibe la replicación del ADN del VHB. Guidotti et al. cruzaron ratones transgénicos del VHB con el gen de la proteína quinasa (PKR) y ratones deficientes en el gen de la RNasa L, respectivamente, y descubrieron que tanto el IFN2α/β como el IFN2γ pueden inducir la proteína quinasa para inhibir la replicación del VHB. El IFN2γ y el TNFα no solo pueden escindir la proteína La intacta y causar inestabilidad del ARN del VHB, sino que también inducen un aumento en la actividad de una determinada nucleasa, bajo la cual el ARN del VHB finalmente se degrada, bloqueando así la replicación del VHB.
3. Mecanismo de destrucción de las células diana y eliminación del virus Cuando la infección por VHB no es necesaria en el proceso de eliminación del VHB, se considera que los CTL no sólo protegen el hígado eliminando el virus y controlando la infección. es la principal causa de daño hepático. Los hepatocitos no sólo son células diana para el ataque pasivo después de la infección por VHB, sino también células efectoras inmunes activas que eliminan directamente el VHB. En determinadas condiciones, las propias células del hígado pueden producir IFN y otras citocinas para eliminar directamente el VHB mediante los mecanismos anteriores. Debido a la gran cantidad de células hepáticas, su capacidad antiviral también debería ser muy fuerte. Mientras las células del hígado puedan producir suficiente IFN y otras citocinas, se puede inhibir la replicación viral y eliminar el VHB sin lisar las células.