¿Cómo se realiza la prueba de antagonismo cruzado por difusión en el punto de agar?

1. Materiales y reactivos

(1) pH 8,6, tampón barbitúrico-barbitúrico sódico 0,1 M.

Barbitúrico sódico 10,3g

Barbitúrico 1,84g

Timerosal 100 mg (conservante)

Agua destilada calentada Disolver y ajustar el volumen a 500 ml.

(2) Agar (o agarosa) premezclado al 1%

Disolver 1g de agar (o agarosa) y 100ml de agua destilada.

(3) Gel de agarosa al 1%

Hervir 1g de agarosa y 50ml de agua destilada en el microondas o calentar para disolver en agua (tener cuidado de que no se desborde y añadir agua evaporada), Luego agregue 50 ml de tampón barbitúrico, mezcle bien y almacene a 4°C para su uso posterior.

(4) Antígeno y suero inmune correspondiente.

2. Equipos y equipamiento

Placa de vidrio, molde, aguja perforadora, gotero, caja esmaltada con tapa (que contiene papel de filtro húmedo), incubadora (25 ℃), vasos triangulares, vidrio. agitadores, micromuestreadores y otros equipos comunes.

Cuatro pasos:

1. Preparación de la placa de vidrio de agar precompuesto.

Utilice un gotero para agregar el 1% de agar precompuesto disuelto al vaso. placa, cubra la superficie y colóquela en una incubadora para que se seque (o se seque naturalmente) para hacer una placa de gel.

2. Preparación de la placa de gel

Disuelva la agarosa y vierta la agarosa disuelta sobre la placa de vidrio de agar preparada previamente en la plataforma horizontal para obtener un espesor de aproximadamente 3 ~ 4 mm. Placa de gel de agarosa, perforar agujeros en la forma requerida después de enfriar (tenga cuidado de no dejarla a temperatura ambiente por mucho tiempo, trate de acortar el tiempo de operación y evite que se seque).

Tipo de flor de ciruelo:

3. Difusión inmune y observación de resultados

Agregue el antígeno al orificio central, agregue el suero inmune diluido a los orificios circundantes, dejando 1 orificio. Agregue agua bidestilada como control en blanco (nota: agregue muestra hasta que el pozo esté lleno y no se desborde). Después de que el líquido de los pocillos haya penetrado en el gel, se puede colocar en un termostato (las muestras se pueden agregar repetidamente si es necesario. Cuando el líquido de los pocillos no se haya difundido completamente después de la primera adición, se debe controlar el intervalo de muestreo para evitar la formación de círculos blancos opacos alrededor de los pocillos). Colocar en una caja húmeda a 25°C durante 24 a 48 horas y observar la línea blanca de precipitación producida por el antígeno y el anticuerpo.

El título del suero inmune se expresa mediante la mayor dilución de la línea de precipitación blanca a una determinada concentración de antígeno.

Si no sabes si la concentración de antígeno es equivalente a la del suero inmunológico, también puedes diluir el antígeno varias veces y hacer varios agujeros de flor de ciruelo más para comparar.

4. Conservación de la muestra

Para conservar la muestra, se puede teñir. Los pasos son los siguientes:

(1) Lavar la placa de vidrio. conservar con suero fisiológico Remojar durante 2 a 3 días y cambiar el agua 1 a 2 veces al día para eliminar el exceso de antígenos, anticuerpos y otras proteínas.

(2) Añadir 5% de glicerol o 0,5% de agar al gel de la placa de vidrio remojada y lavada para evitar que se agriete, cubrir el gel con papel de filtro húmedo de alta calidad (sin aire entre los dos), y pasar por líquido a 37 ℃ y dejar secar por completo.

(3) Humedezca el papel de filtro, retírelo con cuidado y limpie la superficie de goma.

(4) Teñir con 0,05 % de amino negro (mezclado con 5 % de ácido acético) durante 65438 ± 00 min, luego decolorar con 5 % de ácido acético hasta que el fondo sea incoloro y almacenar en condiciones secas. También puedes usar de 0,1 a 0,5% de Coomassie Brilliant Blue (preparado con 10 a 20% de ácido acético) durante 5 a 15 minutos, luego decolorar con 10 a 20% de ácido acético hasta que el fondo sea incoloro y guardar en un lugar seco.