Tecnología de electroforesis en agarosa
(1) La electroforesis en gel de agarosa es sencilla y rápida, y las muestras se pueden electroforetizar sin tratamiento previo.
(2) El gel de agarosa tiene una estructura uniforme, un alto contenido de agua (aproximadamente 98% ~ 99%) y es similar a la electroforesis libre. La corriente de difusión de la muestra es relativamente libre y la adsorción de la misma. La muestra es mínima, por lo que el patrón de electroforesis es claro. Alta resolución y buena repetibilidad.
(3) La agarosa es transparente y no tiene absorción de rayos UV. El proceso de electroforesis y los resultados pueden detectarse y cuantificarse directamente mediante luz UV.
(4) Después de la electroforesis, la zona es fácil de teñir y la muestra es fácil de eluir, lo cual es conveniente para la determinación cuantitativa. Prepare una película seca para almacenamiento a largo plazo.
Actualmente, la agarosa se utiliza habitualmente como soporte de electroforesis para la separación de proteínas e isoenzimas. Combinando la electroforesis en agarosa con la inmunoquímica, se desarrolló una técnica de inmunoelectroforesis que puede identificar sistemas complejos que no pueden identificarse mediante otros métodos. Gracias al establecimiento de la tecnología ultramicro, se pueden detectar 0,1 ug de proteína.
La electroforesis en gel de agarosa también se utiliza habitualmente para separar e identificar ácidos nucleicos, como la identificación del ADN y el mapeo de enzimas de restricción del ADN. Este método es fácil de operar, tiene equipos simples, tamaño de muestra pequeño y alta resolución, y se ha convertido en uno de los métodos experimentales comúnmente utilizados en la investigación de ingeniería genética. La separación de ácidos nucleicos mediante electroforesis en gel de agarosa se basa principalmente en su peso molecular relativo y su configuración molecular, y también está estrechamente relacionada con la concentración del gel.
1. La relación entre el tamaño de las moléculas de ácido nucleico y la concentración de agarosa.
(1) El tamaño de las moléculas de ADN en el gel, la distancia de migración (movilidad) del ADN. Los fragmentos y el par de bases son inversamente proporcionales al logaritmo de , por lo que al comparar la distancia de migración del fragmento estándar y el desconocido, se puede medir el tamaño del fragmento desconocido. Cuando el tamaño de las moléculas de ADN supera los 20 kb, resulta difícil separarlas con un gel de agarosa común. En este momento, la movilidad de la electroforesis ya no depende del tamaño molecular, por lo que al separar el ADN mediante electroforesis en gel de agarosa, el tamaño molecular no puede exceder este valor.
(2) La concentración de agarosa se muestra en la siguiente tabla. El ADN de diferentes tamaños debe separarse mediante electroforesis en gel de agarosa de diferentes concentraciones.
Concentración de epi agarosa y rango de separación de ADN
Concentración de agarosa/% 0. 30. 60. 7 0. 9 1. 21. 52. 0
Lineal Tamaño del ADN/KB60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1
2. La relación entre la configuración del ácido nucleico y la separación por electroforesis en gel de agarosa
Isomería El orden de movimiento La velocidad del ADN es: ADN circular covalentemente cerrado (CCCNA) > ADN lineal y ADN circular bicatenario abierto. Cuando la concentración de agarosa es demasiado alta, el ADN circular (generalmente esférico) no puede entrar en el gel, y la movilidad relativa es 0 (Rm=0), mientras que el ADN lineal bicatenario (barras rígidas) del mismo tamaño puede avanzar en sentido largo. dirección del eje. (RM >: 0), se puede ver que la movilidad relativa de estas tres configuraciones depende principalmente de la concentración del gel, pero también se ve afectada por la intensidad de la corriente y la fuerza iónica del tampón.
3. Método de electroforesis
(1) Tipo de gel
La electroforesis en gel de agarosa utilizada para separar ácidos nucleicos se puede dividir en tipos verticales y horizontales (tipo placa). . La electroforesis horizontal consiste en sumergir completamente la placa de gel en 1-2 mm de tampón de electrodo, por lo que también se llama electroforesis por inmersión. En la actualidad, este último se usa más porque es más conveniente preparar geles y agregar muestras, el tanque de electroforesis es simple y fácil de fabricar y se pueden preparar placas de gel de diferentes especificaciones según las necesidades para ahorrar gel, por lo que es más popular.
(2) Sistema tampón
En ausencia de iones, la corriente es demasiado pequeña y el ADN migra lentamente; por el contrario, un tampón con alta fuerza iónica generará una gran cantidad de iones; Calor debido a una corriente excesiva, en casos severos, causará la fusión del gel y la desnaturalización del ADN.
Los tampones de electroforesis más utilizados incluyen EDTA (pH 8,0), ácido triacético (TAE), ácido tribórico (TBE) o trifosfato (TPE), etc.
, la concentración es de aproximadamente 50 mmol/L (pH 7,5~7,8). El tampón de electroforesis generalmente se convierte en una solución madre concentrada y se diluye al múltiplo requerido cuando se usa.
TAE tiene una capacidad de almacenamiento en búfer baja y los dos últimos tienen una capacidad de almacenamiento en búfer lo suficientemente alta, por lo que se utilizan con más frecuencia. Las soluciones concentradas de TBE precipitarán después de un almacenamiento prolongado. Para evitar este inconveniente, almacenar la solución 5X a temperatura ambiente y diluirla 10 veces con una solución de trabajo 0,5X puede proporcionar suficiente capacidad tampón.
(3) Preparación del gel
Utilizar solución tampón de electrodo diluida como disolvente, preparar una determinada concentración de sol en baño maría hirviendo o en horno microondas y verterlo en un recipiente plástico horizontal. marco o vertical En film plástico, introducir en el peine y dejar enfriar de forma natural.
(4) Preparación de la muestra y adición de la muestra
Disolver la muestra de ADN en una cantidad adecuada de tampón Tris-EDTA que contenga 0,25 % de azul de bromofenol u otro colorante indicador, 10 %-15 %. sacarosa o 5%-10% de glicerol para aumentar su gravedad específica y concentrar la muestra. Para evitar la posibilidad de que la sacarosa o el glicerol produzcan bandas en forma de U en los resultados de la electroforesis, se puede utilizar Ficoll (polisacárido) al 2,5 % en lugar de sacarosa o glicerol.
(5) Electroforesis
Las condiciones experimentales de la separación en gel de agarosa de macromoléculas de ADN muestran que el efecto de separación es bueno a baja concentración y bajo voltaje. A bajos voltajes, la movilidad electroforética de las moléculas lineales de ADN es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, cuando aumenta la intensidad del campo eléctrico, la movilidad de fragmentos de ADN más grandes aumenta relativamente poco. Por tanto, a medida que aumenta el voltaje, la resolución electroforética disminuye. Para obtener la máxima resolución de fragmentos de ADN mediante electroforesis, la intensidad del campo eléctrico no debe ser superior a 5 V/cm.
La temperatura del sistema de electroforesis no tiene ningún efecto significativo sobre el comportamiento de electroforesis del ADN en gel de agarosa. La electroforesis generalmente se realiza a temperatura ambiente. Sólo cuando la concentración del gel es inferior al 0,5%, la electroforesis se puede realizar a 4 °C para aumentar la dureza del gel.
(6) Tinción y fotografía
El tinte fluorescente bromuro de etidio (EB) se utiliza habitualmente para teñir, observar bandas de ADN bajo luz ultravioleta, tomar fotografías con un analizador UV o utilizar coagulación El sistema de imágenes de pegamento genera fotografías y analiza datos relacionados. La investigación en bioquímica y biología molecular a menudo requiere la separación electroforética del ADN para la hibridación molecular, y la agarosa no es adecuada para la hibridación. En 1975, Southren creó un método de transferencia in situ de bandas de ADN a una membrana de nitrocelulosa (membrana NC) y luego de hibridación, llamado transferencia de Southren. Posteriormente, Alwine et al. utilizaron un método similar para la transferencia Northern, llamada transferencia Northern. Towbin et al. en 1979 diseñaron un dispositivo para transferir proteínas de geles a membranas de nitrocelulosa. Las proteínas se transfieren a la membrana y luego reaccionan con los ligandos correspondientes, como los anticuerpos, lo que se denomina transferencia Western. Este dispositivo se convierte en membranas, geles, papeles de filtro, etc. Se convierte en una galleta tipo sándwich y utiliza electroforesis de baja tensión y alta corriente para completar la transferencia. En 1982, Reinhart et al. utilizaron la transferencia electrostática para transferir bandas de proteínas enfocadas isoeléctricamente desde geles a membranas específicas, lo que se denomina transferencia Eastern.
En la actualidad, existe una variedad de dispositivos de electroforesis para la transferencia de ácidos nucleicos y proteínas en el país y en el extranjero, lo que hace que la transferencia de transferencia sea rápida, eficiente, repetible y más ampliamente utilizada. Los geles de poliacrilamida también se pueden utilizar para la electroforesis por transferencia, pero al transferir proteínas, el gel no debe contener desnaturalizantes como SDS y urea. También existen muchas opciones de membranas de soporte para electroforesis por transferencia. En los últimos años, las membranas de nailon se han utilizado con más frecuencia porque tienen buenas propiedades mecánicas y no se vuelven quebradizas cuando se hornean. Son más cómodas de usar que las membranas de nitrocelulosa.
A la hora de realizar electroforesis por transferencia blot, es importante tener en cuenta que la fuerza iónica del tampón debe ser baja y el pH debe estar alejado del pI para que la proteína transporte más cargas. En general, se debe utilizar el sistema amortiguador Tris con mejor estabilidad. Tenga en cuenta también que hay burbujas de aire entre el gel y la membrana de soporte. Aumentar adecuadamente el voltaje o la corriente puede aumentar la velocidad de transferencia, pero también aumentará el efecto térmico, por lo que el voltaje o la corriente no deben ser demasiado altos. Generalmente, la electroforesis en gel de agarosa sólo puede separar ADN de menos de 20 kb. Esto se debe a que en el gel de agarosa, cuando el diámetro efectivo de la molécula de ADN excede el tamaño de los poros del gel, bajo la acción del campo eléctrico, el ADN se ve obligado a deformarse y pasar a través de los poros, enderezándose en la dirección de natación, por lo que el tamaño de la molécula tiene un efecto importante sobre la tasa de migración. Si se cambia la dirección del campo eléctrico en este momento, la molécula de ADN inevitablemente cambiará su conformación y se enderezará en la nueva dirección de natación, y el tiempo de giro está estrechamente relacionado con el tamaño de la molécula de ADN.
En 1983, Schwartz et al. diseñaron un gel con gradiente de campo eléctrico pulsado basado en las características del tiempo de relajación elástica (tiempo de residencia extrapolado a 0) de las moléculas de ADN relacionadas con el tamaño de las moléculas de ADN, utilizando dos campos eléctricos verticales no uniformes. alternativamente, para que las moléculas de ADN cambien de dirección en el gel, separando así el ADN según el tamaño molecular. Más tarde, Carle y otros mejoraron la tecnología de electroforesis y descubrieron que la inversión periódica del campo eléctrico también podía separar el ADN macromolecular mediante electroforesis. El sistema de electroforesis consta de un tanque de electroforesis horizontal y dos juegos de electrodos verticales e independientes. Un conjunto de electrodos negativos es N y el electrodo positivo es S; el otro conjunto de electrodos negativos es W y el electrodo positivo es e. Una placa de gel de agarosa cuadrada (10 cm x 10 cm o 20 cm x 20 cm) está centrada a 45 grados, y el campo eléctrico está entre N-S y w-e. El tiempo de cambio del campo eléctrico alterno está relacionado con el tamaño de las moléculas de ADN que se van a separar.
Durante el proceso de electroforesis, las moléculas de ADN se encuentran en un campo eléctrico alterno continuo. Muévase primero al polo s y luego cambie al polo e. Cada vez que cambia la dirección del campo eléctrico, las moléculas de ADN tendrán un cierto tiempo para relajarse, cambiar de forma y de dirección de migración. Sólo cuando la molécula de ADN alcanza una determinada configuración se puede continuar con el tiempo anterior. La dirección neta del movimiento de las moléculas de ADN es perpendicular a la línea de muestreo, de modo que cada componente de la muestra forma su propia área a lo largo del mismo carril. La electroforesis de pulsos alternos puede separar eficazmente grandes moléculas de ADN de millones de pares de bases. Los instrumentos más nuevos tienen ángulos ajustables entre los electrodos y los tiempos de pulso, lo que los hace más cómodos de usar.
Además, las placas de agarosa se suelen utilizar en diversas inmunoelectroforesis combinadas con técnicas de inmunodifusión.