¿Cuáles son los factores que afectan el análisis de ácidos nucleicos (ADN y ARN) mediante electroforesis en gel de agarosa?

Las moléculas de ácido nucleico son moléculas anfolíticas. En el tampón de electroforesis por encima de su punto isoeléctrico, sus bases son inseparables y todos los grupos fosfato están disociados, por lo que las moléculas de ácido nucleico están cargadas negativamente y migran hacia el electrodo positivo durante la electroforesis. La agarosa se extrae principalmente del agar vegetal marino, ha sido modificada por glicosilación y es una molécula lineal con una cadena polimérica. Como medio de soporte de electroforesis, el gel de agarosa actúa como un tamiz molecular, haciendo que la movilidad de las moléculas de ácido nucleico de diferentes tamaños y conformaciones sea muy diferente, logrando así el propósito de la separación. La electroforesis en gel de agarosa es sencilla y rápida. Al ajustar su concentración, la resolución puede cumplir con los requisitos de la mayoría de los experimentos, lo que la convierte en un método común para separar, identificar y purificar moléculas de ácido nucleico. Sin embargo, todavía quedan muchas cuestiones a las que se debe prestar atención durante la operación.

1 Producción de gel

La concentración de gel de 1,1 cambia según las necesidades experimentales, generalmente entre 0,8-2,0. Si se preparan 100 ml de gel a la vez, el gel no utilizado se puede derretir nuevamente, pero a medida que aumenta el número de derretimientos, cuanto más agua se pierde, mayor será la concentración del gel, lo que conducirá a resultados experimentales inestables. El primer método consiste en rehidratar el recipiente. En segundo lugar, pese el pegamento antes de hervirlo y agregue agua hasta su peso original después de hervir el pegamento. Un método aproximado consiste en obtener un valor de hidratación empírico mediante múltiples condiciones de ebullición constante. Esto asegura que la concentración del gel se mantenga básicamente en la concentración original. La tinción de ácido nucleico bromuro de etidio se puede agregar a la agarosa derretida hasta una concentración final de 0,5 t*g/ml y la tinción también se puede realizar después de la electroforesis.

Selección de placas de peine para 1 y 2. Generalmente, cada molde para hacer gel está equipado con múltiples placas de peine con diferentes formas de dientes. Los dientes del peine son anchos y el volumen de muestra es grande. Experimentos de recuperación de fragmentos de ADN, etc. Por el contrario, los dientes del peine son estrechos y delgados, y el volumen de muestra es pequeño, lo que se utiliza para la identificación de productos de PCR y productos de digestión enzimática. La elección de la placa peine depende principalmente del tamaño de la muestra. En términos generales, cuando la cantidad de muestra es pequeña, intente elegir una tabla de peine delgada para la producción de pegamento. En este momento, las bandas de electroforesis son densas y claras, lo que facilita el análisis de los resultados. Además, cada vez que haga gel, asegúrese de que la distancia entre los dientes del peine y la placa inferior sea de al menos 1 mm. De lo contrario, la capa inferior del gel se dañará fácilmente al retirar la placa del peine, lo que resultará en una muestra. fuga después del muestreo. Por supuesto, el daño a la muestra L también está relacionado con el tiempo y el método de extracción del tablero peine. En general, el gel debe enfriarse durante más de 30 minutos antes de dibujar la placa. En situaciones de emergencia, el bloque de gel formado se puede enfriar en un refrigerador a 4°C durante aproximadamente 65.438 ± 05 min. El método para sacar la placa de peine es colocar el tanque de fabricación de gel en el tampón de electroforesis en el tanque de electroforesis y luego aplicar lentamente fuerza vertical. Debido a la lubricación del líquido, la tabla de peine es fácil de sacar y el patrón no se daña fácilmente.

Muestra de dos puntos

Se debe agregar tampón de muestra al tomar el muestreo, porque agregar glicerol o sacarosa al tampón de muestra aumenta la densidad y hace que la muestra se hunda hasta el fondo de L. para obtener instrucciones Durante el proceso de migración de la muestra, generalmente se agregan dos indicadores, azul de bromofenol y azul de xileno, al tampón de carga (vale la pena señalar que el indicador no es un tinte y el tinte de ADN es bromuro de etidio, que puede sólo puede excitarse con luz ultravioleta (la fluorescencia naranja sólo se puede ver a continuación). Generalmente, la solución de almacenamiento del tampón de carga es 6× (10×), lo que significa que su concentración es 6 veces la concentración de trabajo. Cuando se utiliza, el tampón de carga debe diluirse al doble de su concentración. El método de muestreo consiste en sostener la pipeta verticalmente y sujetar el extremo inferior de la pipeta con la otra mano. Cuando la punta de la pipeta ingresa al muestreo L, la muestra se puede inyectar en el muestreo L. Nunca inserte la punta en el fondo de la muestra L y apunte al estándar de peso molecular de ADN apropiado. De manera apropiada, el peso molecular del ADN de la muestra debería estar sustancialmente dentro del rango de los estándares de peso molecular del ADN.

3 Electroforesis

Conecte el electrodo positivo del instrumento de electroforesis al electrodo positivo del tanque de electroforesis y conecte el electrodo negativo al electrodo negativo. Los ácidos nucleicos están cargados negativamente y pasan del electrodo negativo al electrodo positivo. El tampón de electroforesis en el tanque de electroforesis debe ser el mismo que el utilizado para la producción del gel. Lo mejor es que el tampón de electroforesis sea sólo 1 mm más pequeño que el gel. Si hay demasiado tampón de electroforesis, la corriente aumentará y el gel. calentar. Durante la electroforesis, el voltaje aplicado al gel es generalmente inferior a 5 V/cm (refiriéndose a la distancia entre los electrodos positivo y negativo, no a la longitud del gel). El tiempo de electroforesis es generalmente de 3 a 60 minutos, que se puede ajustar. adecuadamente según las necesidades experimentales. A medida que aumenta el voltaje, el tiempo de electroforesis se acorta y las bandas de ácido nucleico son relativamente irregulares y poco claras.

Por el contrario, el voltaje disminuye, el tiempo de electroforesis es más largo y las bandas de ácido nucleico son limpias y claras. Además, si la muestra nada lentamente o no nada después de la electroforesis, compruebe si se han retirado las tiras de sellado en ambos extremos del molde de plástico.

4 Análisis de resultados

Los resultados exitosos de la electroforesis muestran que las bandas estándar de peso molecular son claras y ordenadas, y las bandas de muestra son claras y ordenadas. Si las bandas están borrosas y oscuras, las posibles razones son: ¿Cuál es la masa y la cantidad de bromuro de etidio desde la perspectiva de la electroforesis en gel de agarosa? El bromuro de etidio se descompone fácilmente cuando se expone a la luz, y la solución madre tarda mucho en prepararse o se almacena incorrectamente (generalmente válida dentro de un año a 4°C en la oscuridad), o la concentración final no alcanza 0,5 VG/ ml; el tampón en el tanque de electroforesis se usa demasiadas veces y la capacidad del tampón disminuye. En particular, el tampón TAE debe reemplazarse después de 2 o 3 usos, mientras que el tampón TBE se puede utilizar unas 10 veces.

En el trabajo real, a menudo se encuentra que los pequeños fragmentos estándar del peso molecular del ADN están borrosos porque la concentración del gel de agarosa generalmente no excede 20, y los fragmentos de ácido nucleico más pequeños están dentro de su rango de resolución, mientras que La banda EB es electricidad positiva, por lo que pasará a potencial negativo durante la electroforesis. Los fragmentos más pequeños se pueden teñir nuevamente si el gel se coloca en una solución acuosa que contenga EB (0,5 g/ml) durante 30 minutos. Además, bromuro de etidio (EB) (0,5 # g/m 1).