¿Cuáles son las bandas que se obtienen mediante la detección por electroforesis en gel de agarosa de la electroforesis de ADN?

El bromuro de etidio es una tinción fluorescente altamente sensible que se utiliza para visualizar ADN en geles de agarosa y poliacrilamida. El bromuro de etidio se excita mediante un instrumento estándar de transmisión de luz ultravioleta de 302 nm y emite una señal de color rojo anaranjado, que puede ser capturada por un cabezal de imágenes CCD de un sistema de procesamiento de imágenes de gel o película Polaroid.

La forma más común de observar el ADN en geles de agarosa es teñirlo con el tinte fluorescente bromuro de etidio, que contiene un grupo plano tricíclico que puede incrustarse entre las bases apiladas del ADN. Su unión al ADN tiene poca especificidad de secuencia de bases. En soluciones saturadas con alta fuerza iónica, se inserta aproximadamente una molécula de bromuro de etidio cada 2,5 bases. Cuando se inserta la molécula de tinte, su grupo de planos es perpendicular al eje de la hélice e interactúa con las bases superior e inferior a través de fuerzas de van der Waals. La posición fija de este grupo y su proximidad a la base da como resultado la fluorescencia del tinte unido al ADN con un rendimiento de fluorescencia mayor que el tinte en solución libre. El ADN absorbe la radiación ultravioleta a 254 nanómetros y la pasa al tinte, mientras que el tinte unido absorbe radiación óptica a 302 nanómetros y 366 nanómetros. En ambos casos, la energía absorbida se reemite a 590 nm en la región rojo-naranja del espectro visible. Debido a que el rendimiento de fluorescencia de los complejos de bromuro de etidio y ADN es de 20 a 30 veces mayor que el del tinte sin unión al ADN, se pueden detectar tan solo 10 ng de bromuro de etidio cuando el gel contiene bromuro de etidio libre (0,5 ug/ml). Bandas de ADN.

El bromuro de etidio puede utilizarse para detectar ácidos nucleicos (ADN o ARN) monocatenarios o bicatenarios. La afinidad de los colorantes por los ácidos nucleicos monocatenarios es relativamente pequeña, por lo que su rendimiento de fluorescencia es relativamente bajo. De hecho, la mayor parte de la fluorescencia del ADN o ARN monocatenario se genera mediante la unión del tinte a la molécula para formar hélices intramoleculares cortas.

Aunque la movilidad electroforética del ADN lineal se reduce en aproximadamente un 15 en presencia de este colorante, cuando es necesario conocer el tamaño exacto del fragmento de ADN (como en la identificación de patrones de enzimas de restricción del ADN), la gelificación El gel debe someterse a electroforesis sin EB y teñirse con EB después de la electroforesis. Generalmente no es necesario decolorar después del teñido. Sin embargo, cuando se detectan pequeñas cantidades de fragmentos de ADN (menos de 10 ng), suele ser necesario decolorar el gel teñido.