Cómo utilizar la cromatografía líquida
Introducción a la cromatografía líquida
La cromatografía de gases no puede dar resultados cualitativos de sustancias desconocidas directamente del cromatograma y debe compararse con estándares conocidos. Cuando no existe un control de sustancias puras, la identificación cualitativa es muy difícil. En este caso, se requieren espectrometría de masas, infrarrojos, química y otros métodos. Además, la mayoría de las sales metálicas y sustancias con mala estabilidad térmica no se pueden analizar. La cromatografía líquida de alta resolución puede superar esta deficiencia. Sobre la base de la cromatografía líquida clásica, se introdujeron la teoría y la tecnología de la cromatografía de gases y, a principios de la década de 1970, se estableció un método de análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (expresado como HPLC). La cromatografía líquida que funciona a presión normal suele tardar entre varias horas y decenas de horas en separar una muestra y la eficiencia del trabajo es muy baja. Para esta cromatografía líquida clásica, se intentó aumentar el caudal para acortar el tiempo de separación mediante la reducción de la presión previa a la columna o la reducción de la presión posterior a la columna, pero los resultados fracasaron. Según la teoría de la cromatografía líquida, a medida que aumenta la altura del plato con el aumento del caudal del líquido portador (fase móvil), la eficiencia de la columna se reducirá significativamente. Con la mejora de la tecnología de producción, la gente ha utilizado pequeños (
Conceptos básicos utilizados en cromatografía líquida de alta resolución:
Términos relacionados con el análisis cromatográfico, como valor de retención, coeficiente de distribución, La relación de distribución, la altura de la bandeja, la separación y la selectividad son consistentes con la cromatografía de gases. Las teorías básicas utilizadas en HPLC: la teoría de la bandeja y la teoría de la velocidad también son consistentes con la cromatografía de gases porque la cromatografía líquida utiliza líquido en lugar de gas como fase móvil. entonces la agenda de velocidad H=A B/? C? donde: el término de difusión longitudinal (término de difusión molecular) B/? tiene un efecto diferente en la altura de la placa debido a las moléculas componentes en la fase móvil de cromatografía líquida. sólo una diezmilésima parte del de la cromatografía de gases, y se puede ignorar la influencia del término de difusión longitudinal en la altura de la bandeja. Por lo tanto, el factor principal que afecta a la cromatografía líquida es el término de transferencia de masa Cu, como se puede ver en la Figura 14, cuando. En cromatografía de gases, cuando el caudal de la fase móvil u aumenta en (GC), la altura de la placa h aumenta significativamente (es decir, la eficiencia de la columna disminuye significativamente), mientras que en la cromatografía líquida (LC), cuando el caudal aumenta, la altura de la placa aumenta. no aumenta significativamente (es decir, la eficiencia de la columna disminuye significativamente). Muestra que la cromatografía líquida de alto rendimiento también tiene una alta eficiencia de separación. Además, existen varios tipos de gases portadores en la cromatografía de gases, y sus propiedades no son muy diferentes. Tiene poco impacto en el efecto de separación. Sin embargo, existen muchos tipos de líquidos portadores en la cromatografía líquida y sus propiedades también son diferentes y tienen un gran impacto en el efecto de separación. Importante al seleccionar la fase móvil, se debe prestar atención a los siguientes puntos: la fase móvil tiene una solubilidad adecuada en relación con la muestra, pero no reacciona químicamente con la muestra. No se disuelve con la pureza de la solución estacionaria. la fase móvil debe ser alta (al menos analíticamente pura) y la viscosidad debe ser baja para evitar reducir el coeficiente de difusión de impurezas y componentes en la fase móvil; el caudal debe coincidir con el detector utilizado y no debe interferir con la detección de componentes. -La cromatografía líquida de rendimiento no solo es eficiente, rápida y altamente sensible, sino que también tiene más tipos de fases móviles (líquidos portadores) que la cromatografía de gases. Por lo tanto, se pueden seleccionar dos o más líquidos con diferentes proporciones como fase móvil. Además, las fracciones de cromatografía líquida son más fáciles de recolectar que las fracciones de cromatografía de gases, y la estructura de los compuestos se puede determinar mediante métodos infrarrojos, magnéticos nucleares y otros para facilitar la obtención de muestras puras. -La cromatografía líquida de rendimiento es adecuada para la separación. Analiza muchas sustancias orgánicas y algunas sustancias inorgánicas con altos puntos de ebullición, mala estabilidad térmica y grandes pesos moleculares (por encima de 400). Estas sustancias representan del 75 al 80% del número total de compuestos. Por lo tanto, ha sido ampliamente utilizado en ácidos nucleicos, proteínas, aminoácidos, vitaminas, azúcares y lípidos. Separación y análisis de esteroides, esteroides, hormonas, alcaloides, hidrocarburos aromáticos policíclicos, polímeros, quelatos metálicos, compuestos organometálicos y diversas sales inorgánicas. Sin embargo, la eficiencia de separación actual de la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase estacionaria y la detección de detectores no son tan buenas como la cromatografía de gases. Además, el análisis de gases y sustancias volátiles es muy inferior a la cromatografía de gases. la combinación de cromatografía líquida de alta resolución y cromatografía de gases puede complementarse entre sí.
1. Principio de separación
Cromatografía en gel, también llamada cromatografía de exclusión espacial. Es un método que utiliza diferentes pesos moleculares y diferentes efectos de retardo de algunos geles para separar y analizar los componentes de la mezcla. El principio de separación de la cromatografía en gel es diferente de otras cromatografías y es similar a la función de los tamices moleculares, pero el tamaño de los poros del gel es mucho mayor que el de los tamices moleculares, generalmente de cientos a miles de angstroms. La columna cromatográfica se llena de gel con orificios de cierto tamaño. Cuando la muestra ingresa a la columna cromatográfica, moléculas de muestra de diferentes tamaños (representadas por puntos negros en la Figura 14-2) siguen la fase móvil a lo largo de los espacios externos de las partículas de gel (representadas por círculos abiertos en la Figura 14-2) y al lado de Los poros del gel quedan excluidos de las moléculas móviles y voluminosas, ya que no pueden penetrar en los poros del gel, por lo que pueden pasar suavemente a través de la columna de gel y ser eluidas antes por la fase móvil. Las moléculas de volumen medio tienen una penetración parcial, mientras que las moléculas pequeñas pueden penetrar en los poros del gel y obstruirse, y luego son eliminadas por la fase móvil debido al proceso de equilibrio. De esta manera, los componentes de la muestra quedan bloqueados por diferentes tamaños moleculares y salen de la columna cromatográfica uno tras otro, logrando así el propósito de la separación. La cromatografía en gel óptico que utiliza una solución acuosa como fase móvil se denomina cromatografía en gel de filtración (HFC), y el uso de disolventes orgánicos como fase móvil se denomina cromatografía de permeación en gel (GPC).
2. Fase estacionaria
La fase estacionaria de la cromatografía en gel. El gel es una sustancia blanda y elástica que contiene una gran cantidad de líquido (normalmente agua). con estructura de red columnar. Dependiendo del grado de reticulación y del contenido de agua, los geles se pueden dividir en tres tipos: blandos, semiduros y duros. Los geles blandos (como gel de dextrano, gel de agarosa, etc.) tienen un bajo grado de reticulación, un alto grado de hinchamiento, gran capacidad y son comprimibles, por lo que no se pueden utilizar a alta presión (la presión de funcionamiento es inferior a 3,5 kg/ cm2 o más Bajo). Se utiliza principalmente para cromatografía en gel a presión atmosférica en sistemas acuosos. Los geles semiduros (como el poligel reticulado de estireno divinilbenceno * * *) tienen una capacidad media, alta permeabilidad y alta presión disponible. Adecuado para fase móvil solvente no acuosa; gel duro (como gel de sílice poroso, bolas de vidrio porosas, etc.) tiene pequeña expansión, incompresibilidad, buena permeabilidad, resistencia a alta presión y es adecuado para operaciones de gran flujo.
3. Fase móvil
En la cromatografía en gel, para mejorar la eficiencia del fraccionamiento, se suele utilizar una fase móvil con baja viscosidad y una gran diferencia de índice de refracción con respecto a la muestra. Las fases móviles comúnmente utilizadas incluyen benceno, tolueno, o-diclorobenceno, diclorometano, 1,2-dicloroetano, cloroformo y agua.