Método de detección de pectinasa

[Propósito]

Este método de prueba se utiliza para la actividad catalítica de la pectinasa. Este método es aplicable a diversas preparaciones de pectinasa sólidas y líquidas.

[Descripción]

Este método es adecuado para el análisis y control de calidad de la pectinasa. Sin embargo, no es una predicción de la actividad absoluta de los productos de nuestra empresa y de otras empresas. La actividad enzimática final de varias preparaciones enzimáticas aún puede ejercer una buena actividad catalítica en buenas operaciones experimentales.

[Principio]

La pectina existe principalmente entre la pared primaria y las células de las plantas. La pectina es el polisacárido de la matriz de la pared celular. La pectina incluye dos polisacáridos ácidos (ácido poligalacturónico y ácido ramnoico) y tres polisacáridos neutros (arabinano, galactano y arabinogalactano). La pectinasa es esencialmente una poligalacturonato hidrolasa. La pectinasa hidroliza la pectina, produciendo principalmente ácido β-galacturónico. El método del yodato de sodio se puede utilizar para cuantificar el ácido galacturónico y así determinar la actividad pectinasa.

[Definición de unidad de actividad de pectinasa]

1 g (o 1 ml de enzima líquida) de enzima en polvo puede catalizar la hidrólisis de pectina cada minuto en condiciones de 50,0 ℃ y pH 3,5. La cantidad de enzima que genera 1 μg de ácido galacturónico es una unidad de actividad.

1. Reactivos e instrumentos

*Todos los reactivos utilizados en este estándar son de grado analítico y no requieren ninguna explicación.

1.1 Ácido acético

1.2 Yodo

1.3 Yoduro de potasio

1.4 Ácido sulfúrico concentrado

1.5 Pectina ( Sigma Corporation )

1,6 tiosulfato de sodio

1,7 carbonato de sodio

1,8 almidón soluble

1,9 baño maría

Matraz aforado de yodo 1,10

2. Preparación de reactivos

2.1 Agua ácida con valor de pH de 3,5

Ajustar el agua destilada a 3,5 con ácido acético.

2.2 1 Solución de pectina:

Pesar con precisión 1g de pectina analíticamente pura, disolverlo en agua ácida, hervir, enfriar y filtrar a 100ml.

2.2 Solución de yodo 0,1N:

Pesar con precisión 5g de yoduro potásico, disolverlo en agua destilada, añadir 2,54g de yodo, disolver y ajustar a 100ml.

2,3 0,025 mol/L de tiosulfato de sodio:

Pesar con precisión 6,2 g de tiosulfato de sodio, añadir agua destilada y ajustar el volumen a 1 L.

Indicador 2,4 0,5 de almidón soluble:

Pesar con precisión 0,5g de almidón soluble, ponerlo en agua hirviendo y cocinar hasta que esté transparente.

2.5 Solución de carbonato de sodio 1M:

Pesar con precisión 10,6g de carbonato de sodio y ponerlos en 100ml de agua.

2.6 Ácido sulfúrico 2N:

Absorber 10ml de ácido sulfúrico concentrado y verterlo en 170ml de agua.

2.7 Preparación de muestras de enzimas

Pesar con precisión 1.000 g de enzima sólida o retirar 1 ml de muestra de enzima líquida, diluir a 100 ml, remojar en un baño de agua a 50 °C durante 1 hora. filtrar. El filtrado es la solución enzimática que se va a analizar. La enzima se diluyó 100 veces.

3. Procedimiento

3.1 Tomar 10ml de pectinasa, añadir 5ml de solución enzimática y 5ml de agua destilada (PH3,5) y reaccionar en baño maría a 50°C durante 1 hora.

3.2 Sacar y cocinar durante 2~3 minutos. Después de enfriar, agregue agua hasta 20 ml.

3.3 Tome 5 ml de la solución de reacción en un matraz aforado de yodo de 100 ml, agregue 1 ml de solución de carbonato de sodio 1 M y 5 ml de solución de yodo 0,1 N, agite bien y colóquelo a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 minutos.

Después de retirar el 3,4, añadir 2 ml de ácido sulfúrico 2 N, valorar inmediatamente con solución de tiosulfato de sodio 0,05 N hasta obtener un color amarillo claro, añadir 1 ml de solución de almidón soluble 0,5 y continuar la valoración hasta que desaparezca el color azul.

3.5 En la prueba en blanco, utilice solución de enzima inactivada hervida o agua destilada en lugar de la solución de enzima para la titulación.

3.6 Preparar al menos dos muestras paralelas para cada muestra de enzima.

Cálculo

4.1 Encuentre el promedio de los valores de OD medidos de muestras paralelas.

4.2 Calcular la unidad de actividad enzimática según la siguiente fórmula

Actividad enzimática = [(b-a)* n * 0,5 * 175 * 20 * n * 1000]/[51 * 52 * w * 60]

Unidad: microgramo (ml)

Donde: a: El número de mililitros de tiosulfato de sodio consumidos en la titulación de la muestra.

b: Número de mililitros de tiosulfato de sodio consumidos en la titulación en blanco.

n: concentración molar de tiosulfato de sodio.

0,5: 1 equivalente de tiosulfato de sodio equivale a 0,5 equivalentes de ácido galacturónico.

20: El volumen total del líquido de reacción

51: El volumen de la solución enzimática es de 1 ml.

52: Absorber la solución de reacción

n: Factor de dilución

w: El peso de la enzima en polvo en g o el volumen de la solución de enzima en ml.