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• Cómo prevenir la degradación del ARN durante la extracciónUse desnaturalizante para romper células o tejidos, luego use solventes orgánicos como cloroformo para extraer el ARN, luego precipite, lave, seque y finalmente disuelva. Sin embargo, debido a la ubicuidad de la RNasa, el ARN puede degradarse en cualquier momento, por lo que hay muchas cosas a las que se debe prestar atención durante el experimento. Si no tiene cuidado, todos sus esfuerzos serán en vano. 0T3z(F amp;_,D6c " h6ya 6 _ Pasos generales de la extracción de ARN-O: Y x $ p # s8u 4m 9s Hay cinco puntos clave en el proceso de extracción de ARN, a saber: fragmentación efectiva de células o tejidos de muestra; efectiva Desnaturalización de complejos de nucleoproteínas; inhibición efectiva de ribonucleasas endógenas; aislamiento efectivo de ARN a partir de mezclas de ADN y proteínas, también implica la eliminación efectiva de impurezas de polisacáridos, pero lo más importante es la inhibición de la actividad de la ribosa. Actualmente existen dos métodos principales para extraer ARN: extraer el ácido nucleico total y luego precipitar el ARN con cloruro de litio; extracción directa en condiciones ácidas, el ADN y la proteína entran en la fase orgánica, y el ARN permanece en la fase acuosa en condiciones ácidas. El método de extracción provocará la pérdida de ARN de pequeño peso molecular, y la frecuencia de este método es muy baja en la actualidad, 0s) alterar el tejido → aislar el ARN → precipitar el ARN → lavar el ARN → disolver el ARN → preservar la alteración del tejido y La inactivación de la RNasa se puede realizar al mismo tiempo. Se pueden usar clorhidrato de guanidina y tiocianina para la alteración del tejido. La guanidina ácida, NP-40, SDS, proteinasa K, etc., agregar β-ME puede inhibir la actividad de la RNasa, ` 0 [. 1d*m!]0e2. Generalmente, se utilizan disolventes orgánicos como fenol y cloroformo para aislar el ARN, y después de este paso, el ARN generalmente se distribuye en la capa superior y se separa de la proteína. En general, el ARN se precipita con etanol, 3MNaAc (pH-5,2) o isopropanol @0d ampz7? i, g1@4, y a veces se puede omitir este paso para evitar lavar el ARN. El etanol después del lavado se puede secar, pero no debe estar demasiado seco, de lo contrario no se disolverá fácilmente 3@V"o9v I1J2o9k"z5. Normalmente, se utiliza TE para fundir el ARN; amp J6. Criopreservación de ARN para evitar la contaminación por rastros de ARNasa, eliminar el ARN de muestras ricas en ARNasa, como el ARN aislado del páncreas y el hígado, debe almacenarse en formaldehído para preservar el ARN de alta calidad, especialmente para el almacenamiento a largo plazo. El ARN extraído del hígado de rata básicamente se degradó después de una semana de almacenamiento en agua, mientras que el ARN extraído del bazo de rata. Además, las transcripciones de más de 4 kb permanecen estables después de tres años de almacenamiento en agua. Para aumentar la estabilidad de las muestras de ARN almacenadas, el ARN. se puede disolver en formamida desionizada y almacenar a -70°C. La formamida utilizada para conservar el ARN no debe contener impurezas que degraden el ARN del páncreas. Se puede almacenar en formamida durante al menos un año. , el ARN se puede precipitar añadiendo NaAc a 0,3 M y centrifugar a 12000 xg durante 5 minutos. ampP3[7m*^$U$_ "?:F "Xu*N(?(I) El ARN total se extrajo mediante el método del cloruro de litio: "u;}'I!r'^'^amp;l Este método utiliza alta La concentración de urea desnaturaliza las proteínas e inhibe la RNasa, y el uso de cloruro de litio para precipitar selectivamente el ARN es particularmente adecuado para extraer pequeñas cantidades de ARN tisular de una gran cantidad de muestras. Tiene las ventajas de ser rápido y simple, pero tiene las ventajas de ser rápido y simple. también sufre de pequeñas cantidades de contaminación de ADN y bajo rendimiento de ARN Defectos como pérdida de pequeños fragmentos de ARN #~*S:}9`*r4Z3P reactivo de prueba: "d$r6Q _.I8Q1, solución de cloruro de litio/urea, litio. Cloruro 126 g (3 M) de urea, 360 g (6 M) de agua por 1 litro, esterilización por filtración 7_8w65433.
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